微囊藻毒素-LR（MC-LR）是一种由淡水蓝藻产生的天然毒素，对人类健康和生态系统构成严重威胁。蛋白磷酸酶 2A (PP2A) 是目前唯一公认的MC-LR的有毒靶点。然而，大量研究表明MC-LR的毒性作用并不仅仅依赖于PP2A。迄今为止，尚无MC-LR与其他确切靶点结合产生毒性作用的相关报道，迫切需要破译MC-LR潜在的直接靶点。
2024年12月，南京大学方雷、韩晓冬教授团队在Signal Transduction and Targeted Therapy发表题为“Screening, identification and functional validation of Microcystin-LR direct binding target proteins based on thermal proteomics profiling”的文章，本研究利用TPP热蛋白组学全面鉴定MC-LR潜在的直接作用靶蛋白。通过CETSA-WB和MST测定，MC-LR可以直接结合PSMD4、PSMB9、HDAC2和MAPK1等靶蛋白。功能验证进一步证实MC-LR可能通过与PSMD4/PSMB9结合而抑制蛋白酶体活性，提示蛋白酶体是MC-LR的毒性靶点之一。该研究揭示了MC-LR进入生物体后存在多个靶点，为MC-LR毒性机制的研究提供了有价值的参考。
原名：Screening, identification and functional validation of Microcystin-LR direct binding target proteins based on thermal proteomics profiling
译名：基于热蛋白质组学分析的微囊藻毒素-LR直接结合靶蛋白的筛选、鉴定和功能验证
期刊：Science of the Total Environment
IF：8.2（中科院1区）
发表时间：2024年12月14日
通讯作者：Lei Fang 、Xiaodong Han
DOI：10.1016/j.scitotenv.2024.178047
对热蛋白质组学感兴趣
为靶点探究项目找突破
欢迎和我们一起探讨、发SCI
扫码获取详细方案及报价
01
研究背景
由于全球变暖和不合理的人类活动，全球淡水、湖泊和海洋生态系统中的水体富营养化正在加剧。有害蓝藻可以释放多种毒素，对公众健康和生态系统构成威胁。微囊藻毒素（MCs）分布最广，有>250种变体，其中微囊藻毒素-LR（MC-LR）被认为是危害最大、最常见的变体。MC-LR具有疏水性，可在食物链中转移并在生物体内不断积累，引起肝、肠、脑、肾、肺、心脏和生殖系统的多器官毒性，已被列为人类致癌物。为了破译MC-LR的直接蛋白质靶点，必须全面表征MC-LR的靶点，以彻底阐明MC-LR的毒性机制。
02
研究结果
1.本研究利用不需要化学修饰的TPP热蛋白组学技术来识别MC-LR的潜在结合靶点，避免了可能导致MC-LR自然活性降低的化学修饰问题。
对三种温度（T8、T9和T10）进行LC-MS/MS鉴定分析，处理组和对照组差异明显（图1A-B）。对已知靶点PP2A进行分析，发现MC-LR暴露下PP2A的热稳定性增强（图1C-D），进一步证实了MC-LR与PP2A的结合作用。
图1.采用热蛋白组学（TPP）对MC-LR进行靶标鉴定
对1206个差异表达蛋白进行时序聚类分析和热图分析，发现蛋白表达随不同MC-LR浓度的变化而变化。作者重点关注的是簇4和簇6，它们在对MC-LR的反应中表达上调（图2)。
图2.在不同浓度的MC-LR存在下，差异表达蛋白的富集模式
2.MC-LR暴露下热稳定性增强蛋白的鉴定分析
与对照组相比，低浓度MC-LR组有229个蛋白上调，包括112个“Fold”上调蛋白和117个“High”峰度蛋白（图3A-B）。与对照组相比，高浓度MC-LR组有209个上调蛋白，其中有99个“Fold”上调蛋白和110个“High”峰度蛋白（图3C-D）。（在差异上调的蛋白中，与对照组相比多倍表达的蛋白被标记为“Fold”；那些在对照组中没有表达的被标记为“High”）。
观察到在MC-LR的存在下PP2A的热稳定性也增强，这阐明了PP2A是MC-LR在细胞中发挥毒性作用的明确靶点。取交集得到129个在MC-LR暴露下的热稳定性增强靶蛋白。这些蛋白主要定位于细胞质中，其次是细胞核和线粒体（图3E-F）。
图3.MC-LR暴露下热稳定性增强蛋白的鉴定
对129个在MC-LR暴露下的热稳定性增强蛋白进行GO、KEGG富集分析，蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析（图4-5）。
图4-5.MC-LR暴露条件下热稳定性增强蛋白的生信分析
3.MC-LR与热稳定性增强蛋白结合的验证
基于GO和KEGG通路富集分析的结果，关注到6个MC-LR暴露的热稳定性增强靶蛋白MAPK1、HDAC2、PSMD4、PSMB9、VPS35和FAF1，并进一步验证了它们与MC-LR的结合。
CETSA-WB显示MC-LR对PSMD4、HDAC2、PSMB9和MAPK1的热稳定性影响较大（图6A-D，G-J），但对VPS35和FAF1的热稳定性影响较小（图6E-F，K-L）。
微量热泳动（MST）证明了MC-LR直接与4个蛋白（PSMD4、PSMB9、MAPK1和HDAC2）结合，其中MC-LR和PSMD4的结合能力最强，解离常数（KD）为22.357±14.475nM（Fig.7A-D）。
分子对接预测表明MC-LR与每个靶蛋白之间存在氢键和疏水作用，表明MC-LR与每个靶蛋白都有很好的对接能力（图7E-H）。
图6.CETSA实验验证MC-LR靶蛋白
图7.MST技术和分子对接进行MC-LR靶蛋白的验证
4.蛋白酶体系统是MC-LR结合靶点之一
为了阐明MC-LR对蛋白酶体功能影响，检测了6种正常细胞（AML12、GC-1、TM4细胞）和癌细胞（SHSY5Y、Hepa1-6、HCT116细胞）的26S蛋白酶体酶活性，发现在MC-LR的存在下均受到显著抑制。结果表明，MC-LR具有多器官和多细胞毒性（图8A-F）。
为了评估MC-LR在蛋白酶体降解中的作用，研究了其对lys48连接多聚泛素（K48 polyUb）链的蛋白的影响，这是蛋白酶体降解的主要信号。将6种细胞暴露于MC-LR后，K48 polyUb偶联物显著增加，表明MC-LR严重影响蛋白酶体的降解(图8G-L)。
整体功能验证结果表明，MC-LR可能通过与PSMD4/PSMB9结合，抑制蛋白酶体活性并发挥毒性作用。
图8.MC-LR抑制蛋白酶体活性。用ELISA法检测细胞中26S蛋白酶体的酶活性
03
研究总结
本研究利用TPP热蛋白组学技术全面鉴定MC-LR毒性作用的直接靶点，共鉴定到129个MC-LR的潜在结合蛋白。
细胞热迁移（CETSA-WB）、微量热脉动（MST）、分子对接模拟结果证实，MC-LR可以直接与PSMB9、PSMD4、MAPK1和HDAC2结合。
选择PSMB9和PSMD4进行功能验证，结果显示MC-LR可能通过与PSMB9/PSMD4结合来抑制蛋白酶体活性而发挥其毒性作用，提示该蛋白酶体是MC-LR毒性作用的潜在靶点之一。
本研究突破了对MC-LR常规毒性靶点的鉴定，拓宽了研究视角，为MC-LR的毒性机制提供了可参考的基础。然而，MC-LR结合靶蛋白在影响能量代谢、囊泡转运等过程中的验证有待进一步完善，作者后续研究将在这一方向上进行，旨在揭示MCLR毒性机制的调控网络。
对热蛋白质组学感兴趣
为靶点探究项目找突破
欢迎和我们一起探讨、发SCI
扫码获取详细方案及报价
往期推荐 ·
注：本文原创表明为原创编译，非声张版权，侵删！
关于集思慧远
集思医学主营业务有：：a.专业的医学方案整体设计，利用生物信息学对数据进行深入挖掘分析，并提供干湿结合实验。b.为医药类客户提供新靶点发现及验证服务，通过ABPP/TPP/DARTS等技术结合蛋白质组学加速小分子药物靶点发现。尤其善于运用2022年诺奖化学奖技术点击化学快速高效发现新靶点。c.临近标记等蛋白互作新方法提供蛋白互作研究。d.小分子高通量修饰改造，高通量细胞/斑马鱼药物筛选。改善现有临床药物结构和功能。
集思的荣誉及成果：2017获国家高新技术企业，2020众创板挂牌，2021获江苏省民营科技企业称号。2024荣膺江苏省“专精特新”中小企业、栖霞高新区TOP20明星企业称号。创始人先后获“创业南京”人才计划二等奖，“中国江苏创新创业大赛”优胜奖，“南京市创新型企业家”称号等。
集思的愿景：打造生命科学行业的航空母舰，为人类生命健康保驾护航，为人类生产生活谋福祉。
