欧洲分子生物学实验室Science：环境相关浓度下农用化学品对昆虫的普遍亚致死效应

现代昆虫种群暴露于由杀虫剂、除草剂和杀菌剂等组成的农用化学品混合物中。尽管这些化合物已经单独进行了致死性测试，但它们既不会在自然界中单独存在，也不会仅通过死亡来影响动物。Gandara 等人在果蝇模型中筛选了 1000 多种农用化学品，发现这些分子中的大多数在亚致死水平下会对行为产生影响，在急性暴露后甚至会进一步损害生存率。当他们在田间真实水平上结合使用农用化学品时，作者观察到幼虫发育、行为和繁殖发生了广泛变化。这些结果表明，即使是亚致死水平的农用化学品暴露也会影响昆虫种群。

—Sacha Vignieri

全球范围内昆虫生物量正在下降，这可能是由于气候变化和农药使用所致，但对各种化学物质影响的系统研究仍然有限。在这项研究中，我们使用了一个包含 1024 种分子的化学库（涵盖杀虫剂、除草剂、杀菌剂和植物生长抑制剂）来评估亚致死剂量农药对昆虫的影响。在果蝇中，57% 的化学物质影响了幼虫的行为，更高比例的化学物质损害了长期存活率。暴露于亚致死剂量还会引起磷酸化蛋白质组的广泛变化以及发育和繁殖的变化。当温度升高时，农用化学品的负面影响会被放大。我们在包括蚊子和蝴蝶在内的多种昆虫中观察到了类似的行为变化。这些发现表明，大面积暴露于亚致死剂量的农药会改变昆虫的行为和生理，威胁到昆虫种群的长期生存。

我们将重点放在幼虫阶段，以实现化合物的精确输送和提高检测通量。我们将含有 1024 种不同农用化学品（表 S1）的三种浓度（2 μM、20 μM 和 200 μM）的农药（每种农药和浓度有三个重复）在含有液体食物的多孔板中暴露约 25 只三龄幼虫 16 小时（图 1，A 至 C）。这种设置可确保持续给药并减少毒素回避现象。200 和 20 μM 的浓度是田间应用的典型浓度，而 2 μM 的浓度则反映了环境水平，如美国沟渠和湿地中的草甘膦浓度。

孵化后，我们测量幼虫存活率并拍摄视频以评估行为影响（图 1C）。将存活的幼虫转移到不含杀虫剂的固体食物中（见材料和方法），10 天后计算成蝇数量，以评估长期致死率（图 1C）。

建立了自动流水线来分析视频（图 1D），通过轨迹特征和 LarvaTagger 跟踪单个幼虫并描述其行为（材料和方法）。使用标准方法检测异常值（图 1D和材料与方法），在种群规模上测试行为影响。数据被导入一个开放的关系数据库，该数据库有一个交互式网站，供下游应用（https://agrotoxin.embl.de；图 S1A）。

为了直观地显示库中化学物质的多样性，我们对化合物的摩根分子指纹（图 1E和图 S1B）采用了均匀流形近似和投影（ uniform manifold approximation and projection ，UMAP）降维方法。这样就能快速比较结构-活性关系的相似性。虽然有些组（如拟除虫菊酯类杀虫剂）根据 UMAP 嵌入进行了聚类，但大多数组显示出很强的重叠性（图 S1，B 至 D），这解释了非杀虫剂农药对昆虫系统的潜在影响。

虽然高浓度通常会增加急性致死率（图 S2A），但只有少数化学品在最高浓度下会产生强烈的急性或长期毒性（>50%）（图 1F）。每种情况都进行了一式三份的测试，结果表明急性致死率的可重复性很高（图 S2B），但长期致死率的可变性较高（图 S2，C 和 D），这可能是由于存活率偏差造成的。急性致死率和长期致死率的相关性不强[图 1F；200 μM 时的判定系数 (R²) = 0.06]，有些农药显示出很强的急性致死率，但长期影响很小。

被归类为杀虫剂的化学品（如有机磷、拟除虫菊酯、氨基甲酸酯等；图 1，G 和 H）即使在最低浓度下也会导致大量致死。然而，长期致死率在整个库中很普遍，许多非杀虫剂农药即使在最低测试浓度下也会影响幼虫过夜后的存活率（图 1，I 和 J）。即使在亚致死浓度下（急性致死率小于 10%），库中相当一部分农药（57%）也会影响幼虫的行为（P< 0.05；材料和方法，图 1K 和图 S1E），改变刻板行为（35%）、轨迹（6%）或两者（16%）（图 1 K）。

在导致急性致死的分子中，杀虫剂的比例过高（图 S3），但所有类型的杀虫剂都会影响行为，其中 382 种非杀虫剂杀虫剂会显著改变幼虫的行为（图 S3）。异常游走（材料与方法）与长期存活能力受损的相关性最高（图 S4），突出表明其中一些行为状态的改变与对存活至关重要的生理过程受损有关。此外，来自 ToxCast 的数据表明，对存活率和行为的影响与所报告的非特异性细胞毒性水平并不相关（表 S1 和图 S5），这表明了分子特异性机制。

以神经活性非农用化学分子（即咖啡因）作为对照进行测试，结果发现这些分子引起了显著的行为变化，这种变化比因食物来源或遗传背景不同而引起的变化更为明显（图 S6）。为了控制实验室菌株的近交衰退，我们将其对这些分子的敏感性与在意大利那不勒斯附近收集的果蝇的两个同雌性品系（STR 和 BTI）进行了比较。我们选择了 49 种在欧洲 [KEMI 数据库；表 S1] 或美国 [环境保护署 (EPA)  和美国地质调查局；表 S1] 环境中流行率较高的农药子集（表 S2），以确保样本在化学身份和农药类型方面具有代表性（图 S7A）。这些化合物的反应曲线非常相似（图 S7，B 至 D）。只有四种分子（图 S7D 中为蓝色）在 2 μM 浓度下表现出统计学上显著的急性致死率差异，这突显出除了少数有机磷酸酯化合物外，不同菌株的化学反应曲线相似。此外，来自果蝇杂交合成组 (Dros-OSP) 的五个重组种群对其中三种分子表现出相似的敏感性（图 S7，E 至 G）。由于这些种群包含广泛的遗传多样性，这些结果表明我们的实验室菌株对杀虫剂并没有特别敏感。

为了交叉验证杀虫剂的亚致死效应并确定暴露的分子特征，我们分析了用五种常用杀虫剂（三种化学性质不同的杀虫剂、一种杀真菌剂和一种除草剂；图 2A）处理过夜幼虫的磷酸蛋白质组。对已有蛋白质的翻译后修饰是快速的，并且可能发生在对有毒刺激的转录反应之前。我们在 0.2 μM 的浓度下对幼虫进行了暴露，这个浓度甚至更低，完全符合环境水平。在 0.2 μM 的浓度下，未经处理的成蝇并没有表现出更倾向于在含有这些分子的琼脂平板上产卵（图 S8），这意味着黑腹蝇幼虫在自然环境中可能会面临这些条件。尽管急性致死率各不相同（图 2B），但所有农药在这一较低浓度下都会显著影响幼虫的行为（图 2C）。例如，草甘膦——一种在全球广泛使用的除草剂（27 ）——在 0.2 μM 的浓度下不致死（图2B）——增加了幼虫的转弯频率（头拱），减少了停止频率，从而改变了幼虫的活动轨迹（图 2，D 和 E，以及图 S9，A 和 B）。只有毒死蜱这种毒性最强的化合物（图 2B）引起了蛋白质水平的广泛变化。然而，除 1,2-二溴乙烷外，所有其他物质都改变了处理幼虫的蛋白质磷酸化状态（图 2F），包括那些在所用浓度下不致死的蛋白质（图 2B）。大多数变化是在与肌肉和肌动蛋白生理相关的蛋白质磷酸化模式中检测到的，这可能反映了对活性氧（ROS）和异种生物的应激反应的重要方面（图 S9C）。

先前的研究表明短期暴露于杀虫剂可增加幼虫神经系统中的 ROS 水平一致，所有五种分子都会导致O₂-在大脑中积累，但不会在脂肪体中积累（图 2，G 至 I 和图 S10），并降低幼虫的进食率（图 S11），从而可能影响自然环境中的能量摄入。这些发现表明，亚致死剂量的这些化学物质会对幼虫种群产生普遍影响。

以往的高通量筛选实验设计只能部分模拟果蝇幼虫的自然条件。为了在更真实的环境中测试亚致死农药的影响，我们使用了在德国各地空气样本中检测到的 9 种农药（表 S3）（图 3，A 和 B）。以 0.02 μM 的浓度接触这些化学物质过夜后，未观察到急性致死（图 3B）或行为变化（图 S12），这完全在这些化学物质的标准环境流行范围之内。然而，从孵化到第三龄期，喂食含有这种混合物的固体食物的幼虫出现了广泛的行为变化（图 3C和图 S12），发育延迟约 1 天至化蛹期（P< 0.001，双尾t检验；图3D），并且新成虫的产卵率降低（P< 0.001，双尾t检验；图 3E）。尽管发育延迟在自然种群的预期差异范围内，但对产卵的影响超出了上述野生型菌株测量的生理范围（图 S13）。混合物中包含的任何农用化学品均未标记为杀虫剂（表 S3）。总之，这些发现表明，即使在亚致死条件下和在自然栖息地中发现的浓度下，各种杀虫剂也会损害昆虫种群的适应性。

高通量平台使我们能够研究亚致死浓度农药的生理效应及其与可能导致昆虫种群减少的其他因素（如全球变暖）的相互作用。我们将幼虫种群暴露于 49 种高流行率农药中的每一种（图 4A），并提高过夜孵化温度。暴露 16 小时后，高温不会显著影响幼虫的存活率（图 S14A）。然而，与 25℃或 27℃相比，在 29℃下诱导急性致死的化合物数量大约是前者的两倍（图 4B 和图 S14，B 至 L）。因此，许多在 25℃时致死率较低（<10%）的农药在环境温度仅上升四度时就开始表现出明显更高的致死率（图 4C；25℃ 时 P = 0.300 对比29℃时 P = 0.008，双尾 t 检验）。

例如，杀虫剂林丹（lindane）在 25℃下浓度为 0.2 μM 时不致命（0%），但在 29℃下却具有很强的致命性（79%）。尽管许多分子在 25℃下会改变行为，但在 29℃下的变化通常截然不同（图 4，D 至 F 和图 S14，M 至 P）。一些分子，例如除草剂苯草胺和苯磺酰胺，会显著改变行为，但不会影响急性致死率（图 4G），这强调如果测试仅依赖于致死率，则可能会忽略行为影响。

在工业化农业中，农药经常组合使用，这导致动物同时接触多种化学物质。先前的研究报告了农用化学品对水蚤和蜜蜂等节肢动物系统的非附加效应，但这些组合效应在不同化学品类别中的频率仍不清楚。

为了测试可能的组合效应，我们将幼虫群暴露于 22 种常见农药的所有成对组合（图 4A），浓度为 0.2 μM，并测量了急性和长期致死率。我们发现许多组合之间存在非线性相互作用的证据（图 S15，A 和 B），这表明协同农药相互作用可能很普遍。通过棋盘分析证实了两种组合对急性致死率的协同作用（图 S15，C 和 D）。

我们探索了我们的方法是否可以检测农药对其他昆虫行为的亚致死影响。我们专注于医学和经济相关的物种，例如疟疾媒介蚊子斯氏按蚊（Anopheles stephensi）和广泛分布的传粉昆虫蝴蝶小红蛱蝶（Vanessa cardui）（图 5）。将蚊子幼虫在多孔板上暴露于不同浓度的新烟碱（噻虫啉）、拟除虫菊酯（氯氰菊酯）和杀菌剂（多果定）过夜，然后记录和跟踪它们的运动（图 5，A 至 D）。所有农药在可忽略或低致死浓度下都会导致幼虫移动速度明显变慢（图 5，E 至 P）。对于小红蛱蝶，我们将四龄毛虫暴露于含有这三种相同分子的固体食物中。它们的移动被记录在琼脂平板上并被追踪（图 5，Q 至 S）。虽然只有氯氟氰菊酯表现出一定的致死性（图 5T），但所有三种分子都影响了被处理过的毛虫的运动模式（图 5，U 至 F’）。这些结果强调，亚致死浓度的农药也会影响具有高度生态、经济和临床相关性的物种的行为。

农用化学品对全球粮食安全及疾病控制至关重要，但可能带来副作用。保护昆虫需了解各驱动因素的影响，特别是化学品间的协同作用。为此，开展控制变量实验，为决策提供依据，减少负面影响。

前期研究显示，农药可改变非害虫节肢动物的行为。我们建立了一高通量平台，评估超千种农化品的浓度对行为的影响。结果显示，57%的化学品在亚致死浓度下即可显著改变果蝇幼虫行为，且这种影响超过喂养方式或遗传背景的作用。部分分子在极低浓度下就能降低关键性状，如产卵率。高温加剧了农药的影响，凸显了在实际条件下测试的重要性。

本研究揭示了急性与长期致死率无直接关联，表明存在不同的药效学过程。未来研究应深入探讨这些过程及肠道微生物的作用，生态发育生物学在可持续发展讨论中具有潜力，可提供生物系统对环境变化响应的定量信息。

本研究结果突出表明，许多在环境中广泛使用的农用化学品即使在亚致死水平下也能诱发昆虫物种的行为变化。例如，多丁——一种未报道作用机制的胍类杀菌剂，目前在美国的销售剂量为 20 μM——诱导果蝇幼虫的磷酸化蛋白质组发生广泛变化。与这些变化相一致的是，当使用浓度低于喷洒浓度几个数量级[美国环保署报告]时，多丁会改变苍蝇、蚊子和蝴蝶的幼虫行为（图 2C和图 5）。值得注意的是，虽然低浓度的多丁（0.2 μM）增加了果蝇（图 2C）和小红蛱蝶（图 5，C' 和 F'）的运动活动，但却抑制了斯氏按蚊的运动（图 5，O 和 P）。这一观察结果突显了相同浓度的同一种分子如何在不同物种中引发几乎相反的效果。低浓度的多丁似乎具有刺激作用，而高浓度的多丁则具有抑制作用（图 5，C' 至 F'）。异生物的有效浓度取决于多种因素，包括动物的大小以及接触的方法和时间。因此，较小的水生动物（如按蚊幼虫）接触环境分子的有效浓度较高，这可能导致具有非单调剂量-反应曲线的分子（如多丁）产生不同的生理效应（图 5F）。因此，我们的研究结果表明，应该对下一代农药进行更全面的测试，重点是不同代表性物种的亚致死效应。值得注意的是，这些类型的试验可提供更精确的数据，说明如何在不对整体昆虫生物多样性产生负面影响的情况下，有针对性地控制对医学有重要意义的病媒物种的害虫。

在暴露于杀虫剂的苍蝇种群中检测到的产卵率降低表明，即使在亚致死条件下和在自然栖息地发现的浓度下，这些分子也会损害昆虫种群的适应性。因此，我们提供的经验证据支持了农用化学品作为昆虫种群崩溃的潜在驱动因素，而气候变化可能会进一步加剧这种崩溃。我们建议，包含致死率以外的适应性参数的化学品安全性检测可有助于改进化学品安全性评估，从而更好地保护环境、确保食品供应以及保障动物和人类健康。