最全柱层析（含操作视频）

柱层析技术也称柱色谱技术。一根柱子里先填充不溶性基质形成固定相，将混合样品加到柱子上后用特别的溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据混合物中各组分在固定向和流动相中的分配系数不同经过多次反复分配，将不同组分逐一分离。

根据填充基质和样品分配交换原理不同，离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析是三种分离混合物的经典层析技术。

柱层析分离净化的实验技巧和方法

1、柱层析操作方法的选择

目前 ,柱色谱分离的操作方式 ,主要包括常压分离、减压分离和加压分离 3种模式。常压分离是最简单的分离模式方便、简单 ,但是洗脱时间长。减压分离尽管能节省填料的使用量 ,但是由于大量的空气通过填料会使溶剂挥发 ,并且有时在柱子外面会有水汽凝结 ,以及有些易分解的化合物也难以得到 ,而且还必须同时使用水泵或真空泵抽气。加压分离可以加快淋洗剂的流动速度 ,缩短样品的洗脱时间 ,是一种比较好的方法 ,与常压柱类似 ,只不过外加压力使淋洗液更快洗脱。压力的提供可以是压缩空气 ,双连球或者小气泵等。

2、柱子规格的选择

市场上有各种规格的柱层析分离柱。柱子长了 ,相应的塔板数就高 ,分离就好。目前市场上的柱子 ,其径高比一般在1: 5～10范围 ,在实际使用时 ,填料量一般是样品量的 30～40倍 ,具体的选择要根据样品的性质和含量进行具体分析。如果所需组分和杂质的分离度较大 ,就可以减少填料量 ,使用内径相对较小的柱子 (如 2 cm × 20 cm的柱子 ) ;如果 Rf相差不到 0.1,就要加大柱子 ,增加填料量 ,比如用 3 cm内径的柱子。

3、装柱

柱层析色谱柱的填装主要有湿法和干法两种 ,湿法省事 ,一般用淋洗剂溶解样品 ,也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等 ,但溶剂越少越好 ,不然溶剂就成了淋洗剂了。柱子底端的活塞一定不要涂润滑剂 ,否则会被淋洗剂带到淋洗液中 ,可以采用聚四氟乙烯材料的阀门。干法和湿法装柱没什么实质性差别,只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该有适度的紧密(太密了淋洗剂流速太慢 ) ,并且一定要均匀 ,不然样品就会从一侧斜着流动。同时柱中不能有大气泡 ,大多数情况下有些小气泡没太大的影响 ,因为只要加压气泡就可消失。但是柱子更忌讳的是开裂 ,开裂会影响分离效果 ,甚至报废。

4、溶剂的选择

选择一个合适的溶剂系统是柱层析分离的关键。在选用柱层析洗脱剂时首先要考虑三个方面的因素:溶解性 ( Solubil2ity)、亲合性 (Affinity)和分离度 (Res oluti on)。溶剂应选择价廉、安全、环保的 ,可以考虑石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、甲醇和正己烷等等。但正己烷价格较高 ,乙醚很易挥发 ,二氯甲烷和甲醇与硅胶的吸附是一个放热过程 ,易使柱子产生气泡。其他的溶剂用的相对较少 ,要依不同需要选择。另外值得一提的是 ,由于我们进行的是痕量分析 ,淋洗剂的纯度必须关注 ,一般使用农药残留级或 HPLC级的 ,如果是分析纯的必须进行精制。同时溶剂在过柱后最好回收使用 ,一方面环保 ,另一方面也能节省部分经费。

5、上样

用少量的溶剂溶解样品加样 ,加完后将底端的活塞打开 ,待溶剂层下降至石英砂面时 ,再加少量的低极性溶剂 ,然后再打开活塞 ,如此两三次 ,一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗剂 ,一开始不要加压 ,等溶解样品的溶剂和样品层有一段距离 (2～4 cm) ,再加压 ,这样避免了溶剂 (如二氯甲烷等 )夹带样品快速下行。很多样品在上柱前粘性较大 ,上样后在柱上又会析出 ,这一般都是比较大量的样品才会出现 ,是因为填料对样品的吸附饱和所致。有些样品溶解性差,能溶解的溶剂 (比如 DMF,DMSO等)又不能上柱 ,这样就必须用干法上柱了。

6、淋洗液的收集和浓缩

用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。如果样品与硅胶的吸附比较强的话 ,就不容易流出 ,这时可以采用氧化铝作固定相。柱层析后的淋洗液 ,由于使用了较多的溶剂 ,必须进行浓缩 ,如果待测物具有一定的挥发性 ,最好使用常压挥发溶剂 ,否则易导致检测结果偏低。

做有机合成的都知道柱层析的重要性，下面摘录一些有关柱层析的技术要领。如觉得不错，希望版主能打分啊。呵呵，我需要钱买书。

装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。

 
湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂"走柱子"，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。 

干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂"走柱子"，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于"走柱子"时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。解决的办法是：第一、硅胶一定要天结实；第二、一定要用较多的溶剂"走柱子"，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。 

也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。

上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量芗洗涤后，再加入。湿法较方便，熟手一般采用此法关于TLC和柱层析之我的体会(转)

柱层析和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术。这两项技术掌握与否，对于提高实验的效率至关重要。常见的例子是：在柱层析时，由于层析柱中的硅胶填料装得不均匀（没有填严实），使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花，导致分离效果不好。更常见的例子是：层析柱虽然装得不错，但是由于淋洗剂选择不恰当，结果导致几十毫克产品，用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离。分离同样的东西，熟手可能只需要半个小时，而一个层析技术不过关的人可能半天都不能得到纯品。由此可见，这两项技术掌握与否，对于提高工作效率，减轻工作量，减少有机溶剂的使用，从而对身心健康和环境保护都有明显的作用。 

柱层析关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择则是通过TLC确定。这里要指出的一点是：TLC的作用除了跟踪反应进程，检测试剂和原料纯度外，一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。

上样完毕后，接着即用淋洗剂淋洗。淋洗剂一般采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同，即使两者使用的硅胶都相同，但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释一倍，但又不能稀释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好。

接下来谈TLC，需要切记的是： 

第一、某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开，极性太大，也分不开.一般以目标产物的Rf值在0.3左右为最佳。

第二、点不能点得太浓,否则容易重叠,不易判断,因为如果两个点相近的话,一浓就变成一个点了。第三、板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关，只有两者比较合适才能有一个交好的分离效果。 

选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷<己烷<苯<乙醚<THF<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的作用，常用的溶剂组合有：Petroleumether/Ethyl acetate, Petroleum ether/Acetone, Petroleum ether/Ether, Petroleumether/CH2Cl2, CH2Cl2/ethyl acetate, ethyl acetate/ MeOH, CHCl3/ ethyl acetate

展开剂的比例要靠尝试.一般根据文献中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果。我在实验中，为了实现一个配体与其他杂质有效分离，曾经尝试了所有的溶剂用来两两组合后，最后才找到petroleumether/THF这类不常见的混合溶剂。 

一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例,达到最佳效果，如果没有分开的迹象，最好是换溶剂。

对于在硅胶中这种酸性物质上易分解的物质，在展开剂里在利用TLC跟踪反应时，在点板的时候往往是反应体系的混和溶液点一个点A，每种难挥发的原料各点一个点B,C, D等等，然后所有的原料和反应体系的混合溶剂再共同点一个混合点X，这些点在板上的位置如图所示：A X B C D

这样的好处是展开后可以清楚地看见每个点的位置，把A这个点展开后的各个层份的点与B,C,等原料比较，从而判断原料消失没有，点混合点X的目的在于，方便观察，因为有时候，板展开后，各点的位置有些变形，或者由于边缘效应等等，使得判断不易。

利用TLC判断物质的纯度时，往往要和NMR相结合，因为某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。但有趣的是，由于H NMR可鉴别的纯度也就在95%左右，有时候H NMR现示较纯的东西，一点板就会发现有几个点。所以，两者要结合使用。但是自己以前的样品，则可以只通过点板来判断纯度。

 硅胶柱层析原理

硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。

硅胶柱层析流动相

极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。

硅胶柱层析惯用方法

1、称量：200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶H。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。

2、搅成匀浆：加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。

3、装柱：将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚（氯仿），装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。

4、压实：沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。

5、上样：干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。

6、过柱和收集：柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。收集的例子：10mg上样量，1g硅胶H，0.5ml收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶（200-300目），20-50ml收一馏分。

7、检测：要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。

8、送谱：收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。

注意事项：
1、先根据TLC方法筛选好洗脱剂，使两相邻物质Rf值之差最大化；
2、将柱子必须装平整、均匀；
3、考虑有限柱填料的吸附量；

4、可考虑用梯度法分开并洗脱。

干法快速柱层析技术综合了快速柱层析的速度和分离效果，使用更便宜的TLC 级的硅胶，操作简单，不需要特殊的仪器。干法快速柱层析，使用减压洗脱，避免了加压洗脱时玻璃柱爆炸的危险。另外，柱子是用预定量的溶剂洗脱，把溶剂流干直至再加洗脱剂。这些特性，使得干法快速柱层析技术特别适合梯度洗脱。事实上，这也是开发此类层析柱的首选方式。顾名思义，梯度洗脱使用的使极性逐渐增大的溶剂洗脱。开始时用非极性洗脱体系洗去弱极性成份，然后增大极性洗脱分离极性化合物，这可以节省大量时间，又不失好的分离效果。

        不要忘记，如果你允许空气进入色谱柱，这是唯一的实例。实际上，和所有的经典色谱原则相比，这整个过程就像飞一样，而且效果至少和标准技术一样好，同时成本也大大降低。它对分离最高至50 克的量大的样品尤其有用。缺乏经验的人不要尝试这种柱子。这项技术，曾被本文作者使用，但其实已经在很多实验室普遍使用很长时间了。

1. 装置

    需要的设备很简单，就是把减压抽滤所用的圆柱形多孔漏斗，通过一个锥形插口转换头连接到一个圆底烧瓶上，另外侧边的一个插口连接到水泵（图1）。要纯化的样品量决定了使用的漏斗的大小和洗脱液的接收体积。具体建议参见表1。

        如果你熟练掌握此法，一个砂芯玻璃漏斗和几个50ml或100 ml的玻璃瓶也是一样的，笔者长期用此法过柱子，比combi flash来的都快，但是此法对溶剂极性敏感性要求较高，你要对自己的样品的极性非常熟悉，对溶剂的洗脱效果也要非常熟悉，才能很好地使用此法。

2. 洗脱体系的选择

    一般不管什么，先用最小的极性溶剂冲洗一二瓶溶剂，选择的洗脱体系应该是TLC 时目标产物的Rf 值为0.5 左右的溶剂。虽然没有特别不适合这种技术的溶剂，但己烷、乙醚、乙酸乙酯和甲醇的各种组合对于大多数的分离来说已经足够了。因为是减压条件，一些收集的溶剂会蒸发，可能会冷却接液装置，以至于大气中的水份会在装置上凝结。这不会影响分离效果，但如果柱分时间过长，一些水分还是会进到收集的洗脱液当中。使用弱挥发性的庚烷代替石油醚可能会有所帮助。

3. 装柱

    这种色谱柱用的是TLC 级的硅胶，不加石膏粘合剂。这比快速柱层析所用的硅胶要便宜，而且对各种干法柱来说，活性已足够。对每种大小的漏斗所推荐使用的硅胶数量，足够在顶部留下充分空间，用来在装柱并抽实后加洗脱液。硅胶可以按表中推荐的量称取，但更为简单的是，直接在漏斗中加满硅胶，当硅胶抽实后顶部留出的空间就可以用来添加溶剂。在抽实的过程中有这样一种倾向，对大柱来说尤其如此，硅胶脱离漏斗边缘或形成裂缝，这些在柱上可能看不见。为了有好的装柱效果，用玻璃塞在表层尤其是边缘用力研磨压实。不用担心柱表层的状态，用刮勺在漏斗周围反复的轻敲就很容易弄平。当柱彻底压实装好后，用洗脱体系里小极性的溶剂对柱子预洗脱。如果柱子装的好，溶剂前沿看起来会是不断下行的直的水平线。保持硅胶表面覆有溶剂，直到溶剂进入接收瓶中，然后可以让硅胶抽干。记得检查柱前柱后的任何异常。如果溶剂前沿不是水平的，把溶剂抽干，重新压实，再次预洗脱。绝对不能用装的不好的柱子进行分离。压实的硅胶表面足够结实以加溶剂，所以不需要加保护的沙层。

4. 上样和洗脱

     用最小量的预洗脱溶剂把样品溶解，在柱底抽吸的情况下，均匀地将其加到硅胶表面。冲洗样品溶解瓶，把洗液加到柱上，直到所有样品全被转移。如果样品在预洗脱溶剂里溶解不好，将其溶于组合极性最小的洗脱剂里，可以迅速溶解。用上样的溶剂，按照表里所推荐的溶液体积（对难分离的用更小量），开始梯度洗脱。让柱子抽干，将第一部分接液转移到试管或其它方便的容器中，清洗烧瓶和漏斗柄。当柱子抽干时，准备下一份洗脱液，递加5%的极性。重复这样的洗脱程序。持续这样的梯度洗脱，直到用纯的大极性的溶剂洗脱。如有需要，继续这样洗脱。当目标产物从柱中洗脱出来时，停止梯度洗脱，用同样比例的溶剂再洗脱几份，是很有利的。分离过程中，应该用TLC 分析接收液。作为一个大致的指导原则，目标产物从柱中洗脱出来的时间是，目标产物在该洗脱溶剂里的TLC 的Rf 值为0.5。当超过100 mg的样品纯化，目标产物从柱中洗脱出来时，漏斗柄的下部会起泡沫。如果产物是固体，它可能会在漏斗柄或接收瓶上结晶，尤其是分离量大样品时。要确保在两份收液之间，彻底清洗接受瓶和漏斗柄，并检查确保固体不会阻塞洗脱。典型的低程度的产物横向扩散带，常常意味着纯化合物的洗脱组分相对较少，减少了交叉污染的份数。如果粗样中不含聚合物，样品会很好回收。

5. 硅胶处理

    洗脱完成后，抽干硅胶，转移到硅胶残留柜中。通常翻转柱子并敲打，所有的硅胶都会出来。要留心，不要把硅胶尘弄到实验室的空气中。

常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分离的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。

常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等：吸附剂一般要经过纯化和活性处理，颗粒大小应当均匀。对吸附剂来说粒子小、表面积大，吸附能力就高，但是颗粒小时，溶剂的流速就太慢，因此应根据实际分离需要而定。供柱色谱使用的氧化铝有酸性、中性和碱性3种。酸性氧化铝是用1％盐酸浸泡后，用蒸馏水洗至氧化铝的悬浮液pH为4，用于分离酸性物质；中性氧化铝的pH约为7．5，用于分离中性物质；碱性氧化铝的pH约为10，用于胺或其它碱性化合物的分离。

因硅胶略带酸性，只能用于对酸不敏感的化合物的分离。常用300-400目的柱硅胶或H硅胶。若化合物的Rf值相差较大，则可考虑使用２00-３00目硅胶以加快层析速度。

另：因吸附剂的比表面较大，天气潮湿时或长期放置中吸附的水分会对分离效果产生极大的影响（相当于大大增加了固定相的极性导致样品分不开），因此应将吸附剂放入９０～１００度烘箱内烘２小时后，取出在干燥器中冷却后再使用。使用的硅胶，不用时一定要密封，防止吸潮。TLC所用的硅胶板一定要保存在干燥器里面，或使用前在红外烘箱里干燥一段时间。

化合物的吸附性与它们的极性成正比，化合物分子中含有极性较大的基团时，吸附性也较强，氧化铝对各种化合物的吸附性按以下次序递减：

酸和碱>醇、胺、硫醇>酯、醛、酮>芳香族化合物>卤代物、醚>烯>饱和烃  

压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。

加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球是常用的手动加压的方法。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。

体会：过柱时是否加压要具体分析，通常情况下直径比较粗的柱子用常压即可，因其横截面积的缘故淋洗剂的流速已足够快。通常控制柱子下端液体流速大约在0.5~1滴每秒的范围比较合适。

减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。一般不推荐使用。

从理论上讲应该是粗长的好。柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了。

现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，若需要时可增至100倍，具体选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分Rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的长度，也可以减小淋洗剂的极性等等。

细长柱子可以增加塔板数，但是也会增加过柱的时间使样品在固定相中扩散影响分离效果。

溶剂的选择是重要的一环，通常根据被分离物中各种成分的极性、溶解度和吸附剂的活性等来考虑先将要分离的样品溶于一定体积的溶剂中，选用的溶剂极性应低，体积要小。如有的样品在极性低的溶剂中溶解度很小，则可加入少量极性较大的溶剂，使溶液体积不致太大。样品的展开首先使用极性较小的溶剂，使最容易脱附的组分分离。然后加入不同比例的极性溶剂配成的洗脱剂，将极性较大的化合物白色谱柱中洗脱下来。常用洗脱剂的极性按如下次序递增：

己烷和石油醚<环己烷<四氯化碳<三氯乙烯<二硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<丙醇<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸

常选用石油醚，乙酸乙酯。正己烷价格比较高。使用乙醚、二氯甲烷等沸点较低的溶剂时，它和硅胶的吸附是一个放热过程，特别是夏天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些。由于硅胶中的活性羟基，用甲醇可能会洗下来一些硅胶中的东西，所以产品如果想过元素分析的话要留神，应该经过后继处理，比如说重结晶等。

展开剂的比例要靠尝试.一般根据文献中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果。

体会：１）过柱的淋洗剂极性通常要比过板时极性要小。一般为了得到更好的分离，通常是要把样品的Rf值调到0.2-0.3之间，不过，许多情况下，如果接受瓶小一些，即使Rf值在0.5，0.6。 

　　　２）尽量避免使用毒性较大的溶剂，如氯仿，可考虑用石油醚与乙酸乙酯调配。

　　　３）当混合溶剂作为淋洗剂时，要考虑所用溶剂的沸点差异在使用过程中挥发程度不一样而造成的极性改变。

　　　４）对于Rf值接近的化合物分离，可尝试极性相近但由不同溶剂组成的混合体系作为淋洗剂可能会产生意想不到的效果。例如石油醚:乙酸乙酯＝５０:１与石油醚:二氯甲烷＝５:１的极性相近（仅是例子，具体比例有些忘了）的极性差不多，但是后者的分离效果可能优于前者。

６．装柱 

柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂，会被淋洗剂带到产品中的，可以采用四氟节门的。装柱可采用湿法和干法两种，二者各有优劣。无论采用哪种方法装柱，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且都不要有裂缝或气泡，虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，导致柱子开裂，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。 

湿法装柱：关闭柱子下端活塞，把硅胶用适量的溶剂拌成半透明状的均匀稀糊（更像是汤），此时应充分搅拌，仔细观察没有气泡后，以玻璃棒引流倒入事先装有少量溶剂的空柱子中，然后打开活塞让溶剂流出，硅胶自然沉降。

注意：１）装柱溶剂极性不大于过柱淋洗剂；２）倒入硅胶稀糊应有耐心防止液体流击出气泡留于柱内；３）过程中若已产生气泡，则可趁着硅胶尚未完全沉降时用长玻棒搅动溶剂液面下的有气泡处的硅胶可将其赶跑。待硅胶至所需高度后另加溶剂加压走柱，注意硅胶柱上方应时刻保留有一段溶剂！本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。缺点是所须溶剂体积较大（当然装柱时用溶剂可以重复使用），耗时长。一般说来湿法装柱较干法紧密均匀，建议初学者采用。

干法装柱：是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，再用水泵在柱子下端直接抽，当硅胶不再下落时，保持水泵抽气状态下，从柱子上倒入溶剂，注意倒入的溶剂流量必须大于水泵抽气流量以保证柱子上方时刻保留一段溶剂！待溶剂前沿走到活塞时关闭活塞，注意此时因柱内负压溶剂仍在飞快往下走千万别让柱子干了！撤走水泵，待柱内液面不再下降，此时柱子的下半部分是均匀的而上半部分可以看见有气泡，打开活塞，倒入足够的溶剂后从上端用剪去缓冲球的双连球（即直接鼓气）加压，可将上半部分压均匀无气泡。若想柱子装得紧密些，可用淋洗剂多走几次柱子。

本法的优点是装柱较方便，速度快，特别是装体积较大的柱子特别能显示时间优势（当然大柱子因为溶剂走得太快容易抽干所以对技术的熟练程度要求更高些）。最大的缺陷在于抽气时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），不太适合低沸点的淋洗剂如乙醚，二氯甲烷（易产生气泡）。解决的办法是：第一、硅胶一定要压结实；第二、一定要用较多的溶剂“走柱子”，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。

不论用湿法或干法装柱，若最后装好时硅胶表面不平整，可用干净玻棒将最上面约１厘米的硅胶重新捣松，待其自然降落后，再加点溶剂压紧即可。

 7、上样 

样品上样分湿法、干法两种。上样的基本要求是使样品以尽可能小的厚度上到柱子上，采用哪种方法应根据样品的实际情况而定，无论哪种都要求样品中不含大于淋洗剂极性的溶剂。

湿法上样：适合湿法的样品应该是粘度不大均匀液体样品或者在小极性溶剂（极性不大于淋洗剂）中溶解度非常好的固体样品（保证上样过程中不会析出）。用于溶解样品的溶剂体积应越少越好。打开活塞，控制柱子上方溶剂恰好流干时关闭活塞，即用滴管吸取样品，沿柱子内壁于硅胶面上方0.5cm以内距离均匀地加样，待样品布满硅胶面后打开活塞，继续加样。加样的速度以柱子不出现气泡为限。

待所有样品上完后，用尽可能少的溶剂洗剂样品瓶，待样品在硅胶上恰好走干后依上样法将溶液加到硅胶上。（若样品量比较大则可省去该步）。另取干净滴管从上样处上方沿柱子内壁淋洗，确定所有样品开始在柱子中展开后可加入大量溶剂开始过柱。若担心上样及加溶剂过程中会将柱子表面弄破可考虑在上样前先在柱子上加一层石英砂。过程中时刻保持柱子不要干出气泡或裂纹！

很多样品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系，仍可用湿法。可是有的上样后在硅胶上又会析出，这时候建议采用干法上样。

干法上样：干法就是把待分离的样品用少量低沸点大极性溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂，注意必须在油泵上完全抽干大极性溶剂！如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层，注意保留足够的溶剂使加入的干粉恰好能被覆盖以防柱子开裂（溶剂太多也不好，相当于增加了上样厚度）。此时加入的干粉层中可能会有大量的气泡，但由于是松的，可以用玻棒稍做搅拌以除去气泡，同样要保持硅胶表面的平整。

有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如DMF,DMSO等，会随着溶剂一起显色是一个很长的脱尾，这些溶剂虽溶解性好，但是沸点太高不易除去应避免），这时就必须用干法上柱了。

用于吸附上样的硅胶要求：１）样品和硅胶的量比例问题：应尽可能地少用硅胶，可先按1：2尝试，保证在旋干后固体是均匀的，不能看到有样品颗粒析出（那说明有的样品没有吸附在硅胶上）。若有，则应重新用溶剂溶解后再加入硅胶重新抽干。２）硅胶颗粒通常要比作为固定相的大，以保证能尽快脱附降低上样厚度。

也可以在硅胶的最上层填上一小层石英砂或盖张滤纸或加块棉花，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，可以什么都不用。

8. 样品的收集

用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出。这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。

另外，收集的试管大小要以样品量而定，特别是小量样品，如果用大试管，可能一根就收到了三个样品。如果都用小试管那工作量又太大。