文章题目：Reactive oxygen species are regulated by immune deficiency and Toll pathways in determining the host specificity of honeybee gut bacteria
期刊：Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
影响因子：9.4
发表时间：2023
关键词：蜜蜂肠道微生物，ROS，宿主免疫反应，宿主特异性，前列腺素
参考文献：Guo L, Tang J, Tang M, et al. Reactive oxygen species are regulated by immune deficiency and Toll pathways in determining the host specificity of honeybee gut bacteria. PNAS, 2023, 120(33): e2219634120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219634120.
1.研究背景
l动物胃肠道常存在多样且丰富的共生微生物，宿主特异性在多种动物的肠道微生物中被观察到，包括哺乳动物、鸟类和社会性蜜蜂等。理解其形成和维持机制对揭示宿主-微生物相互作用原理至关重要。
l社会性蜜蜂（如蜜蜂、熊蜂和无刺蜂）共享五种核心肠道细菌，不同蜂种具有宿主特异性的肠道微生物组成，且核心肠道细菌在不同宿主中呈分化谱系。蜜蜂肠道微生物群落与宿主共同进化，其祖先可能与现存社会性蜜蜂的共同祖先建立了共生关系，是研究宿主特异性机制的良好模型。
l已知肠道微生物定植会激活蜜蜂免疫反应，且不同乳酸菌菌株对 Toll 免疫通路基因表达有不同影响，但蜜蜂免疫系统是否及如何区分本土和外来肠道微生物，以及涉及的分子机制尚不清楚。
2.研究目的
l已知肠道微生物定植会激活蜜蜂免疫反应，且不同乳酸菌菌株对 Toll 免疫通路基因表达有不同影响，但蜜蜂免疫系统是否及如何区分本土和外来肠道微生物，以及涉及的分子机制尚不清楚。
l明确本土和外来吉氏类杆菌在蜜蜂肠道定植过程中，是由宿主免疫反应还是细菌对免疫效应物的抗性差异所介导。
l识别参与抑制外来吉氏类杆菌菌株的关键免疫通路和代谢产物，揭示蜜蜂维持肠道共生特异性的机制。
3.科学问题
l蜜蜂免疫系统如何区分本土和外来的吉氏类杆菌（Gilliamella）菌株？
l哪些免疫通路和代谢产物参与了对非本土吉氏类杆菌（Gilliamella）菌株的抑制？
l免疫相关基因和代谢物在调控非本土菌株定植过程中是如何相互作用的？
4.实验材料与方法
l实验材料：细菌菌株：选用来自西方蜜蜂的吉氏类杆菌（Gilliamella）菌株W8127和来自熊蜂的菌株B19101。
l实验动物：无菌（GF）蜜蜂（包括西方蜜蜂和熊蜂）。
l交叉接种实验：将两种菌株分别接种到GF西方蜜蜂和熊蜂体内，通过定量PCR和菌落计数法测定细菌数量，比较不同菌株在本土和非本土宿主中的定植情况。
l转录组分析：对接种后12小时和48小时的蜜蜂后肠进行转录组测序，分析基因表达差异，确定与免疫相关的差异表达基因（DEGs）及富集通路。
l免疫基因表达测定：采用qPCR测定接种后12小时蜜蜂后肠中抗菌肽（AMPs）和免疫通路相关基因的表达。
lRNA干扰实验：针对IMD和Toll通路中的Relish和dorsal-1基因设计dsRNA，喂食给新出现的GF蜜蜂，同时接种吉氏类杆菌菌株，测定基因表达和细菌数量，以探究免疫通路对细菌定植的影响。
l体外抗菌实验：检测蜜蜂AMPs对两种吉氏类杆菌菌株的抑制作用，通过抑制圈测定和最小抑菌浓度测定评估。
l活性氧（ROS）测定：用DCFDA染色和过氧化氢测定试剂盒测定接种后不同时间点蜜蜂后肠中的ROS水平；通过qPCR测定与ROS生成和降解相关基因的表达；进行ROS清除实验，喂食维生素C后测定细菌数量和ROS水平，以研究ROS对细菌定植的影响。
l代谢组学分析：采用液相色谱-质谱（LC-MS）分析接种后12小时和48小时蜜蜂肠道代谢物变化，比较两种菌株定植后的代谢组差异，筛选差异代谢物，特别是前列腺素（PG）相关代谢物。
l药物干预实验：给接种B19101的蜜蜂喂食PG合成抑制剂（萘普生和阿司匹林），测定细菌数量、免疫相关基因表达和ROS水平；在萘普生处理组中补充PGD2，观察对上述指标的影响，以明确PG在免疫调节中的作用。
5.结果与讨论
l宿主特异性与免疫反应差异：交叉接种实验明确显示吉氏类杆菌具有显著的宿主特异性，本土菌株在宿主肠道中的定植数量远远高于非本土菌株。转录组分析表明非本土菌株B19101在蜜蜂肠道中诱导了更为强烈的免疫反应，涉及多个代谢通路和免疫相关基因的表达变化。
l免疫通路对细菌定植的影响：IMD和Toll免疫通路在蜜蜂对吉氏类杆菌的免疫反应中起着至关重要的作用，非本土菌株B19101能够显著上调这两个通路相关基因的表达。RNA干扰实验证实抑制Relish和dorsal-1基因的表达会导致非本土菌株B19101的定植数量显著增加。
l活性氧（ROS）在细菌定植抑制中的作用：非本土菌株B19101定植后会导致蜜蜂后肠ROS水平显著升高，ROS能够抑制非本土菌株的定植，且Duox是产生ROS抑制该菌株的关键基因。
l前列腺素（PG）对免疫调节的影响：非本土菌株B19101定植后会引起蜜蜂肠道中PG相关代谢物的变化，PG参与了蜜蜂对非本土菌株的免疫调节，与Duox-ROS系统相关，且PG的产生可能与PLA2水解细胞膜磷脂释放AA有关。
图1 IMD和Toll途径对本土和非本土Gilliamella菌株定殖显示出相反的影响。(A) 实验设计示意图。新出现的GF蜜蜂接种了每种Gilliamella菌株并用dsRNA喂食。采集接种后12小时后肠用于基因表达评估。接种后5天收集后肠用于细菌丰度定量。(B和C) RNAi组在B19101(B)和W8127(C)定植蜜蜂中的细菌丰度，Relish和两个转录本dorsal-1、dorsal-1A和dorsal-1B的表达情况。(D) 四个AMP基因在B19101定植蜜蜂RNAi组中的表达情况。用GFP dsRNA处理的蜜蜂作为对照。在B-D中，每个点代表一个肠道。使用Mann-Whitney检验分析数据。结果是由两个独立实验重现并组合起来的。ns不x显著，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
图2 蜜蜂外来肠道共生菌群谱系免疫调节示意图模型。非本土Gilliamella菌株诱导PLA2上调并产生AA，进而AA产生PGs，PGs是宿主基因在IMD和Toll通路中的调节因子。然后，转录因子Relish和dorsal进入细胞核并诱导Duox转录，随后产生ROS来抑制非原生细菌。然而，本土菌株诱导较少的PGs，并且不触发随后的ROS产生。实线表示以前的研究和我们的研究证明的过程。虚线表示从基因表达和转录因子结合预测推断的过程。PGTP: PGs的转运体；Cox：由AA产生PGs的环加氧酶，昆虫的功能等效基因是过氧化物酶；PLA2：磷脂酶A2。
