01
研究背景
02
研究发现
03
临床意义
04
实验策略
05
数据解读
图1：PIDD1突变类器官中神经祖细胞的失调
Figure 1 展示了在PIDD1突变类器官中神经祖细胞的失调情况，通过对不同基因型的类器官进行免疫染色和细胞计数分析，探讨PIDD1突变对神经祖细胞的影响。
A. 为了研究PIDD1突变对神经祖细胞的影响，作者对对照组、患者组、敲入组和救援组的类器官在第70天进行了免疫染色，标记CC3、CTIP2和SOX2。黄色虚线标出了皮层板（CP）、次生神经管区（SVZ）和室管膜区（VZ）。结果显示，各组在这些标记物的表达上存在差异。
B. 通过对SVZ-VZ区域每平方毫米的CC3阳性细胞进行定量分析，结果显示患者组的CC3阳性细胞数量显著增加，提示细胞凋亡增加。
C. 为了进一步分析神经祖细胞的状态，作者对对照组、患者组、敲入组和救援组的类器官在第70天进行了SOX2（神经祖细胞标记）和HOPX（oRG细胞标记）的免疫染色。结果显示，患者组中SOX2和HOPX阳性细胞的分布与其他组存在差异。
D-E. 对SVZ区域每平方毫米的HOPX（D）和SOX2（E）阳性细胞进行定量分析。结果显示，患者组的HOPX和SOX2阳性细胞数量显著减少，提示神经祖细胞的分化和增殖受到影响。
结论：PIDD1突变导致类器官中神经祖细胞的凋亡增加和分化失调，影响神经祖细胞的正常功能。
图2：PIDD1突变类器官中的皮质板缺陷
Figure 2 对比了对照组、患者组、敲入组和救援组类器官的皮质发育情况。
A. 为了观察皮质层神经元的分布，作者对D70的对照组、患者组、敲入组和救援组类器官进行了CTIP2和SATB2的免疫染色，CTIP2和SATB2分别标记深层和上层皮质层神经元。通过黄色虚线标出了皮质板（CP）、次生室管膜区（SVZ）和室管膜区（VZ）的界限。
B. 通过对A中类器官的VZ、SVZ和CP相对厚度进行定量分析，结果显示PIDD1突变组与对照组相比，SVZ和CP的厚度发生了显著变化。
C. 为了进一步研究SATB2表达细胞的分布，作者对D120的对照组、患者组、敲入组和救援组类器官进行了SATB2的免疫染色。
D. 通过对C中SATB2表达细胞在五个相等区域中的分布进行定量分析，结果显示PIDD1突变组与对照组相比，SATB2表达细胞的分布模式发生了显著变化。
E. 通过对C中SATB2表达细胞从类器官表面到底部的归一化密度进行定量分析，结果显示PIDD1突变组与对照组相比，SATB2表达细胞的密度显著降低。
结论：PIDD1突变导致类器官中皮质板的发育缺陷，表现为SVZ和CP的厚度变化以及SATB2表达细胞的分布和密度异常。
Figure 3 为了研究PIDD1突变对类器官转录组的影响，使用单细胞RNA测序技术分析了对照组、患者组、敲入组和补救组的类器官。
A. 使用UMAP投影展示了对照组、患者组、敲入组和补救组类器官中所有细胞的分布。图中标识了兴奋性神经元和处于祖细胞与神经元状态之间的过渡细胞。
B. 通过点图展示了用于细胞类型分类的已知标记基因的表达情况，涵盖了整个数据集。
C. 热图展示了在放射状胶质细胞（RG）、外放射状胶质细胞（oRG）、中间前体细胞（IPC）和分裂中间前体细胞群中的富集GO术语的-log10（调整后的P值）。比较了患者与对照组、敲入与对照组、患者与补救组三种条件下的变化。左侧和右侧热图分别显示了上调和下调的GO术语。每个比较中，RG和oRG的前17个显著GO术语被绘制出来。为IPC和分裂IPC群绘制了从RG和oRG列表中选择的GO术语。灰色框表示在比较中未显著上调或下调的GO术语。
D. 点图展示了不同细胞群中PIDD1的表达情况。
E. 条形图展示了在患者类器官中PIDD1表达细胞的上调（左）和下调（右）GO通路，与对照类器官相比（n=4）。
F. 点图展示了在对照组、患者组、敲入组和补救组整个类器官中mTOR通路基因的表达情况（伪批量分析）。
G. 展示了所有类器官基因型（所有细胞群）中PIDD1和mTOR通路基因的基因表达相关性（r）。统计测试使用了双尾Fisher精确检验（e）或Pearson相关性检验（g），P值阈值为<0.05。分析的类器官数量为：对照组n=4，患者组n=4，敲入组n=2，补救组n=2。
结论：PIDD1突变导致类器官中多种细胞群的转录失调，特别是影响了与mTOR通路相关的基因表达。
图4：质谱分析揭示PIDD1突变体和MDLS类器官中失调的蛋白质通路
Figure 4 通过质谱分析探讨了PIDD1突变体和MDLS类器官中蛋白质通路的失调情况。
A-B. 为了比较患者类器官与对照类器官在第70天的蛋白质表达差异，作者使用火山图展示了差异表达蛋白（DEPs）和选择的通路，并进行了通路富集分析。结果显示，在患者类器官中，有一些通路下调，而另一些通路上调。
C-D. 为了分析敲入类器官与对照类器官在第70天的蛋白质表达差异，作者使用火山图展示了差异表达蛋白和选择的通路，并进行了通路富集分析。结果表明，敲入类器官中也存在通路的上下调现象。
E-F. 为了探讨MDLS类器官与对照类器官在第70天的蛋白质表达差异，作者使用火山图展示了差异表达蛋白和选择的通路，并进行了通路富集分析。结果显示，MDLS类器官中同样存在通路的上下调现象。
G. 为了评估蛋白质翻译水平，作者分析了质谱数据集中的平均蛋白质翻译情况。箱线图显示了数据的第25到第75百分位数，中线代表中位数，须线代表最小值和最大值。通过双尾配对t检验，结果显示蛋白质翻译水平存在显著差异。
H. 为了展示敲入类器官和MDLS类器官与对照类器官之间，以及患者类器官和MDLS类器官与对照类器官之间的富集GO术语，作者使用热图进行了展示。颜色条表示-log（调整后的P值），结果显示了显著富集的GO术语。
结论：通过质谱分析，研究揭示了PIDD1突变体和MDLS类器官中存在显著的蛋白质通路失调，这可能与这些类器官的特定生物学特性有关。
Figure 5 探讨了PIDD1突变对类器官中mTOR信号通路活性的影响。
A. 为了研究PIDD1突变对mTOR信号通路的影响，作者对对照组、患者组、敲入组、救援组和MDLS类器官在第70天进行了pS6的免疫染色。结果显示，PIDD1突变类器官和MDLS类器官中pS6的表达在SVZ区域明显降低。
B. 通过定量分析SVZ区域内pS6的相对强度，结果显示PIDD1突变类器官和MDLS类器官的pS6强度显著低于对照组。
C. 作者进行了类器官裂解物的免疫印迹实验，以检测mTOR通路的组成成分。结果显示，PIDD1突变类器官和MDLS类器官中mTOR通路的活性标志物表达水平降低。
D. 对pS6/S6比值的条带强度进行了定量分析，结果显示，与对照组相比，PIDD1突变类器官和MDLS类器官的pS6/S6比值显著降低。
E. 对pAKT(S473)/AKT比值的条带强度进行了定量分析，结果显示，与对照组相比，PIDD1突变类器官和MDLS类器官的pAKT/AKT比值显著降低。
结论：PIDD1突变类器官和MDLS类器官中mTOR信号通路的活性显著降低，表明PIDD1突变可能导致mTOR信号通路的低活性。
Figure 6 探讨了mTORC1激活剂NV-5138对PIDD1突变类器官和MDLS类器官中mTOR通路活性不足和皮质板增厚的影响。
a. 为了研究NV-5138对mTOR通路的影响，作者对照组、患者组、MDLS组、敲入组和拯救组的D70类器官进行了免疫染色，标记pS6和CTIP2。结果显示，NV-5138处理后，皮质板、次生室管膜区和室管膜区的pS6信号强度有所恢复。
b. 图示展示了NV-5138对mTORC1通路的作用机制。
c. 通过定量分析D70类器官中次生室管膜区的pS6信号强度，发现NV-5138处理显著提高了pS6信号强度。
d. 通过定量分析D70类器官中皮质板、次生室管膜区和室管膜区的相对厚度，结果表明NV-5138处理后这些区域的厚度恢复至正常水平。
e. 为了进一步验证NV-5138的作用，作者对照组、患者组和敲入组的D120类器官进行了免疫染色，标记pS6和SATB2。结果显示，NV-5138处理后，pS6信号强度和SATB2阳性细胞的分布得到改善。
f. 通过定量分析D70类器官中皮质板区域的pS6信号强度，结果显示NV-5138处理显著提高了pS6信号强度。
g. 通过定量分析D120类器官中皮质板区域的pS6信号强度，结果显示NV-5138处理显著提高了pS6信号强度。
h. 通过定量分析D120类器官中SATB2表达细胞在皮质板区域的分布，结果表明NV-5138处理后SATB2阳性细胞的分布更为均匀。
结论：mTORC1激活剂NV-5138能够恢复PIDD1突变类器官和MDLS类器官中mTOR通路的活性不足，并改善皮质板的增厚现象。
06
主要结论
07
讨论总结
