前置知识
引物是一种短的DNA或RNA序列，用于在PCR（聚合酶链式反应）和其他分子生物学技术中扩增和检测特定的DNA或RNA序列。
引物通过与目标序列的互补碱基配对来定向扩增所需的DNA或RNA片段。在分子生物学研究中，引物的设计是非常重要的一步，因为它直接影响到PCR扩增的特异性和灵敏度。
以下是文章作者“我叫一休”同学汇总的关于引物设计和验证的经验心得，希望能对大家的实验有帮助。
一、普通PCR与荧光定量PCR引物设计上的相同注意点
1.序列的查找是一致的，在NCBI上搜索不同物种的同一基因，序列选取应在基因的保守区段，选择合适片段长度
2.引物长度（primer length）常用的是18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度太高，不适合 DNA 聚合酶进行反应
3.3’端最好不要有A，5’端可以容忍二聚体，但3’端一定不要有二聚体
4.不要有连续的GGG 或CCC、GCGC、CGCG之类，不要有错配，前后引物的退火温度要差不多，差异在2度以内
5.避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构
6.Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%
7.引物之间的TM相差避免超过2℃
8.引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基，引物3'端要避开密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
9.引物的设计好后使用Blast 验证
各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如 GC 含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；
用作克隆目的的 PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。
如果实在满足不了这么多要求，那么就：
1、引物与模板配对好；
2、两个引物退火温度差不多；
3、每个引物的 GC 含量不要太高或太低；
4 、引物最好没有回文序列；
就这 4 点就很好了。如果还是满足不了！只要前2点就够了。
二、荧光定量引物的特定要求
做荧光定量PCR时，用SYBR Green I 法时的一对引物与一般 PCR 的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。
荧光定量PCR引物设计的要求：
1、避免重复碱基，尤其是 G.
2、引物的退火温度要高，一般最好要在 60 度以上；
3、GC含量40-60%.
4、3'端最后 5 个碱基内不能有多于 2 个的 G 或 C.
5、正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。
6、引物的产物大小不要太大，80～150 bp 最为合适。
三、引物设计后的NCBI BLAST引物验证
BLAST 的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列；
如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。
以HSP70为例
F:ATGTTGCTCTCTCCAAGAATAACGTT
R:TCAGTTCTTCTCCTCCTTCTTTTCCTG
1、未克隆全长序列
方法一
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
方法二
(1)
引物中间空一格
(2)
数据库选nr比较全面
选择你物种的拉丁学名
(3)
相似比较
(4)
一一对应直线,即为完全匹配
2、克隆全长序列
>HSP70表示该序列名称
>+名称
(1)
(2)
(3)
在本条序列中引物特异性较好
文稿：我叫一休
校对：樊振华
素材：Canva
参考资料：
https://www.labmanager.com/benefits-of-electronic-pipettes-533
https://www.snapgene.com/guides/polymerase-chain-reaction
