一、流式细胞术（Flow Cytometry）的基本概念
Flow:流动的+cyto:细胞+metry:度量=流动状态下对细胞的检测
流式细胞术是一种利用激光和荧光检测器对细胞进行快速、多参数、定量的分析方法。
二、流式细胞仪的组成和工作原理
1.液流系统：提供动力，使单细胞在鞘液的包裹下在流动状态下经过激光的检测。
2.光学系统：细胞结合着荧光染料，经过激光激发，产生光学参数。分为散射光信号和荧光信号。
3.电子系统：将光学信号转换为电子信号，进行后续分析。
由于光学系统是流式细胞术中的重点，接下来我会对这部分记性能详细的解读。
首先是散射光信号：常用的两个散射光信号是前向角散射光（Forward Scatter, FSC）和侧向角散射光（Side Scatter, SSC），前者表示细胞的相对大小（不是具体大小），后者表示细胞的颗粒度（例如细胞当中细胞器的多少和细胞表面的粗糙程度）。
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然后是荧光信号：我们在前期样本准备阶段，可以使用荧光标记的单克隆抗体对样本进行染色，做多色分析。光学系统得到的荧光信号，可以反映该抗原的表达量。即，样本中目的抗原的表达量越高，它能结合的荧光素偶联抗体越多（在荧光染料强度相同的情况下），荧光信号就越强。
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但是在实践中，实验结果却经常会受到细胞的自发荧光、非特异性染色、荧光通道串色、仪器的电子扰乱等多个因素的干扰而出现偏差。为了避免这些难以避免的因素对荧光染料强度的干扰，研究人员提出了染色指数（Stain Index）这一概念。
这一概念只考虑了抗体克隆与质量、荧光团纯度和质量、目的细胞、激光线及其功率等因素。染色指数基本与荧光染料的强度呈正相关。在常见荧光染料当中：PE＞APC＞FITC＞PerCP。
三、多色流式细胞术的荧光染料搭配原则及注意事项
1.根据机器配置选择最亮的荧光染料
大多数流式细胞仪都有着两个或多个激光器（在使用你的流式细胞仪之前，必须要先了解到你的流式细胞仪激光器的数量、检测器的数量以及滤光器的类型，流式细胞仪究竟能同时检测多少颜色是由这几点共同决定的），同时有着四种、五种甚至更多波长可供选择：
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多色荧光染料尽量选择不同激光激发的染料。在同一激光激发的染料中进行选择时，优先选择荧光强度高的染料，以保证最佳分辨率，尤其是应用于一些很难染色的抗原，例如某些转录因子时。
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2.平衡抗原表达量和染料荧光强度
多色流式检测不同于单色流式检测，在单色检测时，我们可以随意选用荧光强度强的染料，但在多色检测时，由于要尽量在不同激光激发的染料当中进行选择，如果要检测的抗原较多，那么就难免会出现因为颜色的限制，我们不得不给某些抗原分配强度较弱的染料。
在这种情况下，荧光强度低的染料可以分配给表达量高的抗原，从而让表达量低或未知的抗原或罕见细胞群被强度更高的荧光染料染色（例如PE或APC），以检测到更高丰度。做到合理的配色，从而让多种抗原的检测信号既均衡又清晰。
3.使荧光染料的光谱重叠达到最小
我们在学习流式细胞术之初，会经常听到“补偿”一词。因为当两种荧光染料的光谱重叠时，其信号会相互干扰，应用荧光补偿技术就是为了减少这种干扰。
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举个例子：
在补偿之前，在用蓝光激发(488nm)后，FITC染料的光谱主要在FITC特有的通道中被检测到，但光谱尾部却位于用于检测PE染料的滤光片范围内。这些信号就成了PE通道中的假阳性信号，也就是说FITC阳性的细胞将出现PE阳性。
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为了去除这部分假阳性，就需要进行补偿。用仅用FITC标记的样品（单阳性样品）（N色分析就需要设置N个单阳性管）。然后可以在流式细胞仪中进行调节，直到在PE通道中看不到FITC信号。在补偿之后，FITC光谱仅在特定的FITC的通道中可以检测到。
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但补偿越大，补偿后信号的分辨率就越低。因此由不同激光激发的染料时多色流式检测的首选，但要检测的指标越多，这一规则和尽量选择荧光强度高的染料的规则越容易冲突。因此，牺牲个别荧光染料的强度来平衡多个指标检测的准确性是有必要的。
4.减少对细胞的活性和状态的扰动
流式细胞仪不但可探测细胞表面的荧光，也可探测细胞内的荧光。因此，如果要检测细胞表面的分子，一定要保证细胞的活性，还应尽可能保持细胞静止，通常在4度进行操作。否则，荧光抗体进入死细胞内，会产生非特异结果。
5.避免串联染料带来的假阳性
串联荧光染料是指通过共价键的方式将两种染料串联，其中一种染料的发射光谱和另一种染料的激发光谱部分重叠，这会产生一种非放射性的能量转移，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低得多（荧光淬灭），而受体发射出来的荧光却大大增强（荧光敏化）。
结合我们在上面提到的“使光谱重叠达到最小”，我们可以将串联的两种染料看作是一种新的发射光谱和激发光谱远远分开的染料，这种串联染料就比传统的单分子染料更有优势。
本文作者是"Algernon"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
文稿：Algernon
校对：煲仔饭
参考资料：
https://www.abcam.com/content/designing-a-multicolor-flow-cytometry-panel
https://images.app.goo.gl/Z9cDbsnD8PC6ybGr8
