今天小编和大家一起分享的是发表在Molecular Cancer（IF27.7）的文章，MIR22HG acts as a tumor suppressor via TGFB/SMADsignaling and facilitates immunotherapy in colorectalcancer.
此篇研究是研究长非编码RNA（lncRNA）MIR22HG在结直肠癌（CRC）中的作用机制，以及其对免疫疗法的影响。文章通过一系列的实验和分析，揭示了MIR22HG作为一个肿瘤抑制因子，通过TGFβ/SMAD信号通路发挥作用，并促进免疫疗法在CRC中的效果。
1.分析lncRNA在CRC中的表达模式和功能，特别是MIR22HG的作用。
2.探索MIR22HG在CRC中的肿瘤抑制机制。
3.研究MIR22HG如何影响CRC的免疫疗法效果。
1.利用细胞实验（MTT和transwell实验）和动物模型研究MIR22HG对CRC细胞活力和迁移能力的影响。
2.通过机制研究，探讨MIR22HG如何通过TGFβ/SMAD信号通路发挥肿瘤抑制作用。
3.研究MIR22HG表达与CRC患者免疫疗法反应之间的关系。
1.生物信息学筛选差异表达的lncRNAs
从TCGA项目中下载478例结肠腺癌（COAD）患者和41例正常对照，以及166例直肠腺癌（READ）患者和10例正常对照的全基因组表达数据。
使用Wilcoxon秩和检验识别差异表达的lncRNAs，调整p值（FDR）小于0.005且表达变化大于3倍的lncRNAs被认为是显著差异表达的。
识别出232个在COAD中上调和274个下调的lncRNAs，以及26个在READ中上调和184个下调的lncRNAs。特别关注了在两种癌症中共同下调的126个lncRNAs，其中MIR22HG表达显著下调。
2.验证MIR22HG在独立CRC队列中的表达模式
分析了1311个样本的公共CRC数据集，包括GEO数据库中的多个数据集。使用Wilcoxon秩和检验比较CRC组织和正常组织中MIR22HG的表达水平。
结果：
在四个独立数据集中，MIR22HG在CRC中的表达水平显著低于正常组织，且在转移性癌症患者中表达更低。Kaplan-Meier生存曲线和log-rank测试显示，MIR22HG低表达与患者较差的总体生存和无病生存相关。
3.实验验证MIR22HG在CRC细胞中的功能
选择LoVo和HCT116两种CRC细胞系进行实验。
细胞定位和编码潜力分析：通过qRT-PCR检测MIR22HG在细胞核和细胞质中的表达。
siRNA敲低实验：使用siRNA技术敲低HCT116细胞中MIR22HG的表达，检测克隆形成、细胞增殖和迁移能力。
过表达实验：在LoVo细胞中过表达MIR22HG，检测克隆形成、细胞增殖和迁移能力。
结果：
MIR22HG在细胞核和细胞质中均有表达，表明其可能在两个位置发挥调控作用。
敲低MIR22HG显著增加了克隆形成和细胞迁移能力，促进了细胞增殖。
过表达MIR22HG显著减少了克隆形成和细胞迁移能力，抑制了细胞增殖。
4.体内实验验证MIR22HG的功能
使用小鼠皮下异种移植模型和多种转移模型（肠道转移、肺转移和原位肝转移模型）。
将过表达MIR22HG的细胞和空载体转导的细胞分别注入小鼠，观察肿瘤生长和转移情况。
结果：
过表达MIR22HG的肿瘤异种移植模型中，肿瘤体积和重量显著小于空载体转导的细胞。
在多种转移模型中，过表达MIR22HG显著减少了转移结节的数量。
5.机制研究：MIR22HG与TGFβ/SMAD信号通路的相互作用
基因集富集分析（GSEA）：分析与MIR22HG共表达的基因，发现这些基因在多个癌症相关信号通路中富集，包括TGFβ信号通路。
表达相关性分析：计算MIR22HG与TGFβ信号通路中基因的表达相关系数，发现MIR22HG与SMAD2、SMAD3和SMAD4的表达显著相关。
RNA pull-down和质谱分析：使用生物素标记的RNA pull-down和质谱分析技术，识别与MIR22HG相互作用的蛋白质，发现SMAD2蛋白与MIR22HG特异性结合。
RNA免疫沉淀（RIP）实验：进一步确认MIR22HG与SMAD2的相互作用。
机制验证：通过共免疫沉淀实验，验证MIR22HG通过竞争性结合SMAD2，抑制SMAD2与SMAD4的相互作用，从而发挥肿瘤抑制作用。
6.MIR22HG在上皮-间质转化（EMT）中的作用
GSEA分析：发现与MIR22HG共表达的基因在EMT通路中富集。
细胞表型分析：过表达MIR22HG的细胞表现出上皮细胞特性，而敲低MIR22HG的细胞表现出间质细胞特性。
基因和蛋白表达分析：qRT-PCR和Western blot实验显示，敲低MIR22HG显著降低了上皮标记物（E-cadherin、ZO-1和Occludin）的表达，同时增加了间质标记物（N-cadherin、vimentin和fibronectin）的表达。
机制验证：干扰SMAD2表达和TGFβ信号通路活性可以部分逆转EMT基因和蛋白的表达，表明MIR22HG通过SMAD2/SMAD4-SNAI1轴促进EMT过程。
7.MIR22HG在免疫疗法中的作用
免疫相关评分和免疫细胞解卷积：计算CRC患者的免疫评分、MHC评分和免疫细胞溶解活性（CYT）评分，使用TIMER估计混合细胞群体中成员细胞类型的丰度。
相关性分析：发现MIR22HG高表达的CRC患者显示出更高的突变负担、MHC评分、免疫评分和CYT评分，且对免疫疗法的反应更好。
动物模型验证：使用C57BL/6小鼠模型，通过联合MIR22HG和PD-L1阻断治疗，观察肿瘤生长和生存情况。
结果：
联合治疗显著抑制了肿瘤生长，减少了肿瘤重量，延长了小鼠的生存时间。
生物发光成像显示，过表达MIR22HG显著增强了PD-L1阻断治疗的敏感性。
8.MIR22HG增加CD8 T细胞浸润的机制
·相关性分析：发现MIR22HG的表达与T细胞浸润显著相关，且与T细胞标记基因CD8A的表达显著相关。
·流式细胞术分析：过表达MIR22HG显著增加了细胞表面PD-L1和CD8A的表达。
·机制验证：干扰SMAD2表达和TGFβ信号通路活性可以影响MIR22HG对CD8A和PD-L1的表达。
·动物模型验证：在PD-L1治疗的小鼠和CRC患者中，发现CD8A的表达增加，且联合MIR22HG和PD-L1治疗的小鼠显示出更高的Cd8a表达。
通过这些详细的步骤，文章系统地揭示了MIR22HG在CRC中的肿瘤抑制作用及其对免疫疗法的促进作用，为CRC的诊断和治疗提供了新的潜在靶点。
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