我们多数情况无法直接得出观测物的具体参数，需要借助特定的工具、设备与检测技术。对于任何一个检测技术，有一个要求是不言而喻的，即它应该中立地反映检测结果，也就是说它不应该改变检测结果；但这只是一种理想状况，或者说是一个假定，真实情况往往不是如此。
高效液相色谱法（HPLC）是药物分析中常用的一种检测技术，经常用于研究、监控药物的有关物质、含量测定、特定杂质等关键质量属性。
在使用HPLC分析方法时，很多参数如溶剂、流动相、进样瓶、液相色谱仪、实验室环境等经常被默认为中立，但是事实并非如此。
1 溶剂
对溶剂作用的期望只有用于溶解待测物，但它事实上对待测物也有许多其他作用，包括但不限于溶剂效应、与待测物发生化学反应等，这些作用都很可能使检测结果严重偏离真实值。
溶剂效应目前已有很充分的论述，本文不再讨论，详细内容请参见拙著《反相色谱中溶剂效应的表征、原理及解决方法》。
“与待测物发生化学反应”分两种情况：溶剂、溶剂中的微量杂质。
溶剂与待测物发生化学反应一般在溶剂筛选时易被发现；溶剂中的微量杂质与待测物发生化学反应则难以被发现，主要原因有：
1)微量杂质一般成分不明，无法通过理论分析排除该风险；
2)不同来源（如生产商不同或保存时间不同）的溶剂微量杂质含量不同。
由于以上原因，使得溶剂中微量杂质对待测物的作用难以评估，因此对于化学性质较为活泼的待测物，笔者建议应在方法开发时充分评估溶剂的风险，必要时指定溶剂的等级、生产商。
2 流动相
在HPLC方法中，流动相的作用除了从固定相中洗脱待测物外，还很有可能与之发生互相作用，常表现为图谱上出现新的未知峰，杂质的检测结果改变等。
这种情况大多是意料之外，很难在早期发现，经常带来较为严重的后果，如OOS（Out Of Specification，检验结果偏差）。
以反相色谱为例，一般来说用到的水、甲醇、乙腈等化学性质比较稳定，导致上述情况的，多数是添加剂或添加剂中的杂质。
HPLC方法流动相中常用的添加剂，主要分为无机物与有机物两大类。相对来说，有机物的杂质谱较为复杂，较容易发生上述情况。
笔者建议在用到如三氟乙酸、烷基磺酸盐、烷基胺类等添加剂时，应充分评估添加剂对检测结果的影响，必要时指定添加剂的等级与生产商。
3 进样瓶
在实践中，进样瓶对检测结果的不利影响极容易被忽略，或者极难加以防止。
进样瓶对检测结果的不利影响，主要表现在污染与降解。
重复使用的进样瓶由于清洗不彻底引入污染，这是常理，不再赘述。很多实验室为了消除重复使用污染的风险，进样瓶均为一次性使用，然而却忽略了新采购的进样瓶并非足够清洁，其中残留的组分就有可能与活性性质较为活泼的待测物发生作用，生成新的未知物质。
笔者建议，在方法开发时应对比新进样瓶清洗前后的的检测结果，确认进样瓶是否需要清洗后使用。
4 液相色谱仪
某些具有强络合作用的待测物，很可能与液相色谱仪的各个组件，如进样器、色谱柱、管路等中的金属物体发生强吸附，表现为在仪器上的残留。
对于此类化合物，清洗溶剂与流动相必要时需要加入某些强络合剂（如EDTA）将其置换出来，或改变流动相的条件使其不易发生络合作用。
在方法开发期间应基于对待测物化学性质的理解，评估其与液相色谱仪作用的风险，采取必要的应对措施，不能简单地默认液相色谱仪的中立地位。
5 实验室环境
可能影响HPLC分析方法的实验室环境因素，主要是光、热、气三个方面。这些都很容易被忽略或者被默认中立。
光照包括从窗户射入的日光以及实验室照明光。在方法开发期间，应评估日光、实验室光照对溶液稳定性的影响，必要时说明溶液制备、贮存时与光照有关的注意事项。
对于室温控制较差，波动较大的实验室，在方法开发期间应充分评估温度对待测物的溶液稳定性、溶解性的影响，如研究较高温度30摄氏度的溶液稳定性，较低温度15摄氏度的溶解性等。
必要时，在方法开发期间应评估实验室挥发性组分的风险，以避免挥发性污染物通过空气交叉污染导致的检测结果异常。
本文仅列举数个常见的、易被忽略的“非中立”参数，试图探讨如何合理的评估HPLC分析方法潜在的风险，并非已包含所有的可能性——
风险是无限的、资源有限的，这是我们做研究工作的主要矛盾。
（作者：占小兵，江苏万邦生化医药集团有限责任公司）
