撰文丨王聪
来源 | 生物世界公众号
在自然界中，组成生物体的蛋白质都是由20种氨基酸排列组合而来。氨基酸序列包含了它能形成蛋白质的所有结构信息，经过空间折叠后形成特定的三维构象，在细胞内发挥特定的功能——有的与受体结合，激活特定的信号通路；有的结合DNA，控制基因的开关；有的识别病原体，启动免疫反应。
因此，如果能准确模拟出蛋白质折叠后的三维构象，就能改造蛋白甚至从头设计出全新蛋白。然而，天然的生物蛋白都是经过漫长的进化过程才逐渐演化而来，想要无中生有般从头设计出一种全新且有功能的蛋白质十分困难。
近年来，以David Baker被代表的科学家在蛋白质设计领域取得了一系列突破，并因此获得了2024年诺贝尔化学奖。
2024年12月5日，David Baker教授团队在国际顶尖学术期刊Science上发表了题为：Target-conditioned diffusion generates potent TNFR superfamily antagonists and agonists的研究论文。
研究团队使用他们之前开发的RFdiffusion算法来设计肿瘤坏死因子受体（TNFR）的结合蛋白。研究团队在初始设计生成后使用部分扩散设计出具有低皮摩尔级亲和力的结合蛋白，同时还具有高特异性的优点。这些人工设计的蛋白质可以应用于生物学研究，并可能作为潜在的疾病治疗药物。
研究团队表示，为重要的药理学靶点设计高亲和力和高特异性的拮抗剂和激动剂的能力，预示着蛋白质设计时代正在到来，在这个时代，蛋白质结合剂是通过计算而不是通过免疫或随机筛选方法产生的。
如何设计出具有高亲和力和特异性结合目标蛋白的人工蛋白，是计算结构生物学在治疗、诊断等领域的长期挑战。为了解决这一问题，蛋白质设计需要依赖于预先存在的支架组——要么是天然蛋白质，要么是从头设计，它们通常具有明确的三级结构。
2023年7月11日，David Baker 教授团队在 Nature 期刊发表了题为：De novodesign of protein structure and function with RFdiffusion 的研究论文【2】，开发并描述了一种能从头设计生成全新蛋白质的人工智能算法——RoseTTAFold Diffusion，简称RFdiffusion。该方法能生成各种功能性蛋白质，包括在天然蛋白质中从未见过的拓扑结构。
RFdiffusion通过对氨基酸残基的随机空间分布进行逐步去噪来生成新的蛋白质结构。这一扩散去噪过程可以通过条件信息进行引导，从而创造出多种多样的蛋白质结构和功能。例如，在设计结合蛋白时，扩散轨迹是在固定目标物存在的情况下进行的。
事实上，David Baker团队已经使用RFdiffusion生成基于相似理想支架的结合蛋白，同时也测试了无约束扩散，但仅产生了简单的三螺旋或四螺旋束。使用具有规则二级结构元素和堆积的小型理想支架的优势在于，经过序列设计后，相当一部分设计有可能按预期折叠。然而，这种方法限制了形状匹配的程度，特别是对于那些表面相对平坦且缺乏凹陷以供小型迷你蛋白适应的靶标。实际上，目前为止，自主设计的结合蛋白的接触分子表面（CMS）低于许多天然蛋白复合物。
在这项最新研究中，David Baker团队推测，通过使用RFdiffusion直接从完全随机的氨基酸残基分布生成较大蛋白质，可以克服依赖支架或短链方法所能实现的有限形状匹配，而无需依赖于现有支架的指导。
研究团队聚焦于肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF），该家族包含许多重要的药物靶点，例如在炎症性疾病中发挥关键作用的肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）。通过应用RFdiffusion，研究团队生成了96个可能与TNFR1结合的人工设计蛋白，而表面等离子体共振（SPR）实验表明，有6个人工设计蛋白可与TNFR1结合，其中TNFR1_mb1和TNFR1_mb2具有与TNFR1结合的高亲和力，并同时具有高度特异性——只与TNFR1结合，而不与TNFR2结合。
形状互补结合蛋白的扩散研究
为了进一步优化TNFR1_mb2和TNFR1_mb1的亲和力，David Baker团队采用了部分扩散的方法：对骨架部分进行噪声化处理（超过15-25步；50步产生完全随机分布），然后使用RFdiffusion去噪，这产生了与原始设计相似但不同的新骨架。
令人惊讶的是，部分扩散优化处理产生的TNFR1_mb2_pd1与TNFR1的结合亲和力增加了三个数量级，达到低于10 pM。这种低皮摩尔级的亲和力远高于任何此前报道的单体TNFR1结合蛋白。例如，肿瘤坏死因子（TNF-α）作为天然存在的TNFR1结合蛋白，其与TNFR1的结合亲和力也仅为19 pM。
研究团队表示，在优化后的TNFR1_mb2_pd1中，部分扩散所带来的亲和力的显著增加可能是由于额外的界面以及与结合裂缝之间更好的整体拟合，这导致了多个附加接触点的形成。
部分扩散产生具有低皮摩尔级亲和力的结合蛋白
鉴于部分扩散在增加结合亲和力方面的成功，研究团队进一步测试了该方法是否可以应用于其他TNFR家族成员，这些成员在序列上是不同的，但具有非常相似的三维结构。结果显示，这种设计方法可以很好地应用到其他TNFR家族成员的人工结合蛋白的设计、筛选和优化中。
部分扩散产生高特异性的TNFR2结合蛋白
不仅如此，为了实现更广阔的应用，David Baker团队还证明了TNFR1_mb2_pd1可以作为拮抗TNF-α信号传导的人工抑制剂，表明它可能是阻断炎症的候选药物。此外，他们还针对4-1BB和OX40设计了超激动剂，这些高亲和力单体结合剂能够构建多种可溶性信号分子，提供比当前基于天然配体加交联抗体的方法更多的控制。
可溶性低聚物4-1BB和OX40超激动剂的设计
总的来说，这项发表于Science的研究提出了一种基于计算结构生物学设计和开发人工结合蛋白的新方法。这一研究为药理学上的关键靶点设计高亲和力和高特异性拮抗剂和激动剂提供了新的方向，为蛋白质设计领域的一个即将到来的新时代揭开帷幕。
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