引文集锦丨J Exp Clin Cancer Res：浙江大学周济春团队发现二甲双胍通过抑制SLC7A11在乳腺癌中诱导铁死亡

由于高效、低成本和安全性，双胍类药物二甲双胍是最广泛使用的口服抗糖尿病药物。此外，二甲双胍在癌症预防和治疗、抗衰老、抗雾霾等方面的潜在临床应用也备受关注。其中，验证二甲双胍的抗肿瘤临床效果及探索其潜在机制已成为癌症研究的热点。研究表明，二甲双胍通过降低胰岛素水平和诱导能量应激来抑制肿瘤生长。二甲双胍可激活AMPK，抑制mTOR，改变细胞内ROS水平，并抑制线粒体功能。此外，二甲双胍还可调节细胞内铁稳态，这与细胞代谢有关。尽管二甲双胍在调控细胞凋亡、自噬和其他细胞死亡途径的机制逐渐被揭示，但其主要的肿瘤抑制机制尚不清楚。癌细胞对铁的依赖性使其更易受铁催化的坏死（铁死亡）影响。铁死亡是一种铁依赖性和ROS依赖性的细胞死亡方式，其特征包括线粒体嵴减少或消失、外线粒体膜破裂和线粒体膜致密化。通过靶向铁死亡来消除肿瘤正成为一种有前途的肿瘤治疗新方法。研究发现，二甲双胍通过抑制SLC7A11的UFM化在乳腺癌中诱导铁死亡。

01

—

‍

越来越多的证据表明，二甲双胍在临床上具有预防和治疗乳腺癌的巨大潜力，二甲双胍可有效抑制乳腺癌的增殖。一致地，我们的研究还表明，二甲双胍可以以剂量和时间依赖性方式有效抑制一些乳腺癌细胞的增殖（图1a，图S1A和B）。接下来，我们探讨了这些公认的受调节细胞死亡形式是否与二甲双胍在乳腺癌细胞中的抗癌活性有关。我们使用了各种细胞死亡抑制剂，包括Z-VAD-FMK（一种凋亡抑制剂）、necrosulfonamide（一种坏死性凋亡抑制剂）和3-甲基腺嘌呤（3-MA，一种自噬抑制剂）。由于二甲双胍已被证明可调节细胞中的铁稳态，这可能与细胞代谢有关，我们还介绍了一种铁清除剂去铁胺(DFO)。结果表明，DFO恢复了用二甲双胍培养的T47D和MCF7细胞的细胞活力（图1b）。在我们的研究中，与DMSO相比，Z-VAD-FMK、necrosulfonamide和3-MA也略微提高了细胞活力（图1b）。尽管二甲双胍可以诱导细胞凋亡并抑制自噬（图S2A-D），但DFO的作用比细胞凋亡和自噬抑制剂的作用要显着得多（图1b）。此外，二甲双胍促进铁离子的积累，铁离子水平的升高受到DFO的抑制（图1c和d）。碘化丙啶染色证实DFO在T47D细胞中抑制二甲双胍诱导的细胞死亡（图1e）。总之，这些发现表明二甲双胍的抗癌作用需要铁离子，二甲双胍诱导的铁离子增加可能是二甲双胍发挥抗癌作用的机制。

二甲双胍可诱发铁死亡

‍

铁死亡是一种依赖铁的细胞死亡形式。二甲双胍可促进铁离子的积累，而DFO作为一种铁死亡抑制剂，可有效抑制二甲双胍的抗癌作用（图1c和d）。因此，我们假设抗癌作用至少可以部分解释为二甲双胍介导的铁依赖性铁死亡。

为了阐明二甲双胍与铁死亡之间的关联，我们首先研究了二甲双胍对铁死亡形态特征的影响。铁死亡的独特形态特征之一是线粒体体积减少和膜密度增加。透射电子显微镜显示二甲双胍诱导MCF7和T47D细胞线粒体体积减少和膜密度增加（图2a）。接下来，我们关注二甲双胍对铁死亡生化过程的影响，包括总ROS的积累和脂质过氧化，这可以被铁死亡抑制剂(DFO、Fer-1)抑制，以及细胞内GSH水平的降低。因此，用不同浓度的二甲双胍对乳腺癌细胞进行处理，并使用相应的试剂盒对这些指标进行检测。不出所料，我们的结果表明二甲双胍增加了细胞内总ROS和脂质ROS水平，并且脂质ROS的增加被铁死亡抑制剂（DFO、Fer-1）抑制，而DFO和Fer-1本身对这些影响不大（图2b-c和图S1C）。此外，二甲双胍降低了细胞内GSH水平（图2d和图S1D）。此外，我们测试了铁死亡抑制剂（DFO，Fer-1）是否可以逆转二甲双胍的抗癌作用。我们的结果表明，当用二甲双胍处理T47D细胞时，DFO和Fer-1都可以显着挽救细胞活力（图2e）。此外，碘化丙啶染色证实，Fer-1抑制了二甲双胍诱导的T47D细胞中的细胞死亡（图2f）。综上所述，二甲双胍可诱导铁死亡。

03

—

‍

接下来，我们试图研究二甲双胍如何诱导铁死亡。铁死亡由脂质过氧化引发，并受SLC7A11的严格调控，SLC7A11是胱氨酸-谷氨酸逆向转运蛋白的关键成分。GPX4和GSH协同调节脂质过氧化。GSH的产生受SLC7A11的调节，SLC7A11是谷氨酸转运系统中的关键因素，在铁死亡途径中起关键作用。为了确定二甲双胍调节铁死亡的具体分子机制，检测了不同二甲双胍浓度和治疗时间对SLC7A11和GPX4表达的影响。结果表明，二甲双胍以剂量和时间依赖性方式有效抑制T47D和MCF7细胞中SLC7A11的表达，同时转录水平显着升高（图3a和b）。此外，二甲双胍对GPX4表达没有显着影响（图3a）。我们还检查了二甲双胍对其他乳腺癌细胞中SLC7A11的抑制效率。结果显示二甲双胍选择性地抑制了一些乳腺癌细胞的表达（图S3B）。因此，二甲双胍以转录后方式抑制SLC7A11表达，可能通过抑制SLC7A11蛋白水平发挥其抗癌作用（图S1A和B，图S3B）。

为了进一步阐明SLC7A11在二甲双胍抗癌作用中的作用，SLC7A11在T47D细胞中被敲低或过表达，以检测二甲双胍敏感性的变化及其对脂质ROS和GSH水平的影响。结果表明，SLC7A11的敲低显着增加了细胞对二甲双胍的敏感性，并增强了二甲双胍诱导的脂质ROS的产生（图S3C和S4C）。SLC7A11的过表达显着逆转了二甲双胍的抗癌作用和GSH的上调（图3c和d以及图S3C）。此外，SLC7A11的过表达阻断了二甲双胍诱导的脂质ROS增加（图S3D）。此外，SLC7A11的敲低或过表达对细胞增殖没有显着影响（图S4A）。因此，我们得出结论，SLC7A11对二甲双胍抑制肿瘤细胞的作用可能排除了SLC7A11本身对细胞增殖的影响。这些结果表明，二甲双胍可通过下调SLC7A11蛋白水平诱导铁死亡以抑制癌症。

二甲双胍可以调节UFM1的表达

UFMylation是一种泛素样修饰，在乳腺癌的发生发展中起重要作用。UFM1系统在后生动物和植物中是保守的，但在酵母中没有，这表明它在多细胞生物中的特定作用。基于DRUG-SURV数据库分析（DRUGSURV：基于患者生存信息重新定位肿瘤学中已批准和实验药物的资源），我们发现UFM1可以被二甲双胍间接靶向（图4a）。我们推测UFM1可能在二甲双胍的抗癌作用中发挥一定作用。为了检测二甲双胍对UFM1的调节作用，测试了二甲双胍对UFM1表达的影响。结果表明，二甲双胍在一定程度上抑制了UFM1蛋白水平和整体UFMylation修饰水平（图4b），而不影响UFM1转录水平（图4c）。

为了进一步阐明UFM1对二甲双胍抑瘤活性的影响，UFM1在T47D细胞中过表达。结果表明，UFM1的过表达有效阻断了二甲双胍的抗癌作用，恢复了二甲双胍介导的GSH水平抑制（图4d和e）。此外，为了排除UFM1对细胞活力的影响，我们检测了UFM1对细胞增殖的影响，结果表明UFM1的过表达对细胞增殖没有显着影响（图S4B）。此外，UFM1的过表达也阻断了二甲双胍的脂质ROS诱导作用（图S3E）。总之，我们的研究结果表明，二甲双胍可能通过调节GSH水平的UFM1发挥其抗癌作用。

二甲双胍通过抑制SLC7A11的UFMylation下调SLC7A11的表达

铁死亡由脂质过氧化引发，并受SLC7A11的严格调控，SLC7A11是胱氨酸-谷氨酸逆向转运蛋白的关键成分，因此，探索其调控机制有助于在癌症治疗中寻找更多新的诱导铁死亡的治疗靶点。我们的结果表明，铁死亡诱导剂erastin下调了UFM1和SLC7A11的表达，表明UFM1可能参与了铁死亡调控，进一步证实了SLCA7A11和UFM1之间的相关性（图S3A）。为了阐明UFM1在二甲双胍调节铁死亡中的作用，我们首先检测了SLC7A11和UFM1在不同乳腺癌细胞系中的表达。我们的结果表明，SLC7A11和UFM1蛋白水平之间存在明显的正相关（图5a）。接下来，利用公开可用的数据库，我们的生物信息学分析表明，SLC7A11的表达与乳腺癌患者的预后之间存在显着的负相关，而不是UFM1（图5b）。

为了确定SLC7A11和UFM1是否具有调节作用，在敲除UFM1后检测SLC7A11表达的影响。结果表明，UFM1的敲低下调了SLC7A11的表达，而不影响其转录水平（图5c）。此外，UFM1的敲低抑制了SLC7A11的蛋白质稳定性（图5d）。

为了确定SLC7A11是否可以被UFM1修饰，在有或没有UFM1敲低的情况下检测到SLC7A11的UFMylation。发现SLC7A11是UFMylation的底物，其修饰的特异性由UFM1的敲低确定（图5e）。UFM1与靶蛋白的共价结合可以被UfSP2酶逆转。UFMylation修饰的进一步测试表明，SLC7A11 UFMylation可以被UfSP2抑制（图5f）。这些发现将SLC7A11定义为UFM1的新修饰底物。

此外，为了阐明二甲双胍调节SLC7A11的具体分子机制，我们使用二甲双胍处理的细胞来检测二甲双胍对SLC7A11 UFMylation水平的影响。结果显示二甲双胍有效抑制SLC7A11 UFMylation的水平（图5g）。总之，二甲双胍通过抑制SLC7A11的UFMylation下调SLC7A11蛋白稳定性以诱导铁死亡。

二甲双胍可独立于AMPK途径诱导铁死亡

目前已有多项研究表明，二甲双胍可直接作用于肿瘤细胞，通过依赖AMPK和/或不依赖AMPK的信号通路发挥其抗肿瘤生物学作用。我们的结果还表明，二甲双胍可以激活AMPK磷酸化（图6a）。因此，为了确定AMPK通路是否参与二甲双胍对铁死亡的调节，我们首先阐明AMPK的激活是否可以诱导铁死亡。结果显示，AMPK激活剂AICAR增加了脂质ROS的产生并抑制了SLC7A11的表达，这表明AMPK的激活可以诱导铁死亡（图6e和f）。为了进一步确定AMPK通路在二甲双胍诱导的铁死亡中的作用，我们在不存在或存在AMPK抑制剂化合物C的情况下用二甲双胍处理细胞。有趣的是，结果表明二甲双胍和化合物C的组合可以协同增加脂质ROS水平，抑制GSH水平和SLC7A11的表达（图6a，b，c）。此外，化合物C本身可以增加脂质ROS和Fe2+的产生（图6c和d）。因此，这表明AMPK的平衡对细胞存活至关重要，AMPK的激活或抑制可能会在可能涉及铁死亡的细胞中诱导应激反应。简而言之，这些研究结果表明，二甲双胍或AMPK失衡均可诱导铁死亡，而二甲双胍可能在没有AMPK参与的情况下诱导铁死亡。

SAS与二甲双胍的协同作用可有效抑制乳腺癌细胞

我们上述数据促使我们检查用柳氮磺胺吡啶灭活SLC7A11是否会增强二甲双胍诱导的脂质过氧化和铁死亡，从而使癌细胞对二甲双胍敏感。我们用二甲双胍和SLC7A11抑制剂柳氮磺胺吡啶处理细胞。随后，我们用CCK8测定法测试了细胞活力，以确定二甲双胍和柳氮磺胺吡啶组合的协同作用。我们的研究结果表明，柳氮磺吡啶和二甲双胍的组合可以协同方式抑制乳腺癌的增殖，尤其是MDAMB231细胞（图7a，S5A）。此外，直接GPX4抑制剂RSL3也可以与二甲双胍协同作用（图S5D）。此外，柳氮磺吡啶和二甲双胍的组合进一步降低了SLC7A11的表达（图S5B）并诱导线粒体体积减少并增加膜密度（图7b和S5C）。此外，脂质过氧化检测和GSH检测显示二甲双胍和柳氮磺吡啶的组合显着增加了脂质ROS水平并抑制了GSH的产生（图7c和d）。DFO和Fer-1有效地减弱了二甲双胍和柳氮磺吡啶组合的杀伤作用（图7e）。累积地，我们的数据强烈表明柳氮磺吡啶和二甲双胍的组合协同诱导脂质过氧化和铁死亡，从而抑制乳腺癌的增殖。

柳氮磺胺吡啶协同增强二甲双胍体内抗癌活性

我们研究了柳氮磺胺吡啶是否能增强二甲双胍在体内的抗癌活性。将T47D细胞皮下植入免疫缺陷裸鼠的右侧。一周后，荷瘤小鼠被随机分为四组，随后分别用DMSO、二甲双胍、柳氮磺胺吡啶或二甲双胍与柳氮磺吡啶治疗。不出所料，与DMSO组相比，二甲双胍和柳氮磺吡啶显着抑制肿瘤生长（图8a和b）。在四组中，二甲双胍和柳氮磺胺吡啶组合在抑制肿瘤生长方面具有最高的疗效（图8a和b）。此外，用二甲双胍和柳氮磺胺吡啶治疗的小鼠表现出较低的UFM1和SLC7A11表达和较高的4-HNE表达，这经常被用作组织中氧化应激的一般标志物（图8c）。这些数据表明，柳氮磺吡啶使癌细胞对二甲双胍诱导的脂质过氧化和铁死亡敏感，从而导致体内肿瘤抑制。

全文总结

这项研究探究了二甲双胍（Metformin）在乳腺癌中的作用机制，特别是通过诱导铁死亡（Ferroptosis）来抑制肿瘤生长。研究表明，二甲双胍通过抑制SLC7A11的UFM化过程，降低了SLC7A11蛋白的稳定性，从而增加细胞内铁离子和脂质ROS（活性氧）的水平，最终诱导铁死亡。此外，二甲双胍与系统xc⁻抑制剂柳氮磺吡啶（Sulfasalazine）联合使用可以协同诱导铁死亡，显著抑制乳腺癌细胞的增殖。该研究首次揭示了二甲双胍通过诱导铁死亡实现抗癌效果的机制，并提出了UFM1/SLC7A11通路作为潜在的癌症治疗靶点。‍

原文链接：

https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13046-021-02012-7

【iMedicine】本公众号专注医学前沿动态，分享科学普及信息。欢迎关注、投稿、分享和转载，投稿或转载请联系本公众号，喜欢本文请“点赞+在看”支持一下，让医学知识更多传播出去！