引文集锦丨J Exp Clin Cancer Res：韩国岭南大学朴弼勋团队发现脂联素通过脂肪酸代谢重编程诱导乳腺癌细胞凋亡

大量证据表明，肥胖与多种癌症的发病率增加密切相关。肥胖-癌症联系的一个可能机制是肥胖个体中脂肪组织产生的脂肪因子（如脂联素）失调。脂联素显示出多种抗癌作用，但其在肥胖期间的水平下降，表明脂联素信号受损可能促成与肥胖相关的癌症发展。现有研究主要集中在乳腺癌中脂联素的作用，脂联素通过调节细胞自噬、肿瘤促进炎症和炎性小体激活等事件诱导乳腺癌细胞死亡和生长抑制。然而，脂联素调节乳腺癌细胞生死的具体分子机制仍需进一步研究。

肿瘤代谢重编程是癌细胞在恶劣环境中生存和无限增殖的重要适应机制。尽管肿瘤特异性脂质代谢重塑最近才受到关注，但证据表明其在肿瘤发生中的重要作用。许多癌细胞类型对新生脂质生成依赖性增加，尽管肿瘤微环境中脂质丰富。参与脂肪酸合成的基因在乳腺癌组织中过度表达，维持癌细胞的存活。

脂联素被认为是具有广泛细胞代谢活性的脂肪因子，尽管其对癌症代谢的影响研究较少。在生理条件下，脂联素抑制脂质合成，并通过多种信号通路调节肿瘤生长和细胞脂质代谢。脂联素激活自噬，被认为对脂质代谢有影响。

Sirtuin 1 (SIRT1) 是一种调节细胞代谢的重要酶，其在癌症生长中的作用仍存在争议。脂联素通过活性氧生成诱导SIRT1表达，SIRT1可能参与脂联素的抗乳腺癌作用。本研究发现，球状脂联素引起乳腺癌细胞脂肪酸代谢的显著变化，通过抑制脂肪酸合成和激活脂肪自噬及脂肪酸氧化，导致细胞脂质稳态失衡，从而破坏脂筏结构和依赖脂筏的信号传导。同时，SIRT1的激活在脂肪酸代谢重编程和脂联素诱导乳腺癌细胞凋亡中起关键作用。

01

—

‍

为了研究脂联素是否影响乳腺癌细胞的脂质代谢，我们首先检查了它对细胞脂质池的影响。使用Bodipy493/503作为神经脂质的荧光探针，我们发现球状脂联素(gAcrp)以时间依赖性方式降低MCF-7细胞中Bodipy493/503的摄取（图1A），表明脂联素损害细胞脂质预订。在不同类型的乳腺癌细胞中也观察到了这种效应，包括T47D（图1B）和三阴性MDA-MB-231细胞（图1C）。共聚焦显微图像进一步证实了受损的细胞内脂质积累，显示gAcrp处理导致MCF-7（图1D）和MDA-MB-231（图1E）细胞中的脂滴数量急剧减少，如所确定的通过尼罗红染色。总之，这些发现清楚地表明脂联素可降低ER阳性和阴性乳腺癌细胞中的脂质含量。

脂联素诱导的脂质消耗引发乳腺癌细胞的脂筏破坏和凋亡

‍

脂质分子在调节膜结构和膜蛋白介导的信号转导中起关键作用。之前有报道称，脂筏是富含胆固醇和鞘脂的膜微区，用作信号转导分子的分选平台，对细胞脂质稳态的改变高度敏感。由于脂联素诱导乳腺癌细胞中的脂质消耗，我们研究了它是否会破坏膜脂筏结构。通过用霍乱毒素-B(CT-B)荧光标记脂筏，我们观察到CT-B染色在MCF-7(图2A)和MDA-MB-231(图2B)细胞。这种作用与FASN抑制剂TVB-3166的作用基本相似，表明脂联素对脂质的消耗会导致乳腺癌细胞中脂筏微结构域的丢失。鉴于脂筏作为各种受体的信号支架的作用，我们接下来试图验证脂筏解体对某些信号分子的筏依赖性激活的影响。作为一个典型的例子，据报道，LRP6的磷酸化是Wnt的一种辅助受体，并且是经典Wnt/β-连环蛋白信号通路所必需的，据报道仅在脂筏结构域中发生。在此，虽然在存在Wnt3a配体的情况下p-LRP6和脂筏之间存在高度共定位，但脂联素导致脂筏结构完整性的丧失伴随着质膜上p-LRP6表达的显着降低（图2C）。通过蛋白质印迹分析进一步证实了对Wnt配体的反应受损，其中gAcrp恢复了Wnt3a刺激的MDA-MB-231细胞中p-LRP6和活性β-连环蛋白的水平（图2D）。此外，我们发现gAcrp处理导致Akt的长期失活（补充图，图S1A和S1B），另一种信号分子，其磷酸化已被证明是脂筏依赖性的。这些发现表明，脂联素对脂质的消耗会导致脂筏破坏和跨膜信号转导的抑制。

已经证明脂联素降低细胞脂质含量会导致脂筏结构和功能的紊乱，我们推测脂质代谢的改变可能有助于脂联素的抗乳腺癌作用。我们首先证实gAcrp和TVB-3166降低了MCF-7和MDA-MB-231细胞的活力（图S2A-S2D）。有趣的是，通过向培养基中添加牛血清白蛋白（BSA）-共轭棕榈酸，脂联素和TVB-3166降低的细胞存活率显着恢复（图2E和F）。此外，通过caspase-3/7活性测定（图2G和H）和膜联蛋白V染色（图2I）确定，外源性棕榈酸酯还从脂联素和TVB-3166诱导的细胞凋亡中拯救了乳腺癌细胞。总之，这些结果表明，细胞脂质稳态失调至少部分是脂联素诱导乳腺癌细胞死亡的原因。

03

—

‍

细胞脂质库受损可能是由于生物合成减少、降解增加或脂质摄取减少所致。考虑到从头FAS在癌细胞存活和增殖中的重要性，我们接下来检查了脂联素对SREBP-1和FAS调节基因表达的影响。如图3所示，gAcrp以时间依赖性方式显着抑制核SREBP-1的表达，伴随着各自前体形式的短暂减少（图3A和B）。一致地，gAcrp下调SREBP-1mRNA表达（图3C和D），并且还降低了核提取物中SREBP-1与含有SREBP-1反应元件（SRE）的特定dsDNA序列的结合（图3E和F），清楚地表明脂联素抑制了乳腺癌细胞中SREBP-1的转录活性。由于SREBP-1是FAS调节基因的主要调节因子，我们研究了脂联素对SREBP-1抑制的下游影响。在SREBP-1的靶基因中，gAcrp显着抑制FASN的mRNA表达，并以相对较小的程度降低ACC-1、ACLY和FADS2的mRNA水平，而对FADS1和SCD-1没有显着影响。通过蛋白质印迹分析进一步证实了脂联素对FASN的下调（图3H和I）。总之，这些结果表明脂联素通过抑制SREBP-1及其下游靶标来降低FAS水平。

脂联素通过激活乳腺癌细胞中的脂肪吞噬诱导脂肪分解

自噬被认为在调节脂质代谢中起关键作用。此外，自噬激活最近被提出作为脂联素抑制乳腺癌作用的分子机制。因此，我们假设自噬与脂联素对脂质代谢的改变有关。我们首先证实gAcrp诱导MCF-7和MDA-MB-231细胞中的自噬激活，这可以通过增加LCI/LC3-II转化、增强Beclin-1和Atg5的表达以及降低p62水平来证明（图4A和乙）。为了检查脂联素是否促进脂滴的自噬降解，我们分别用抗LC3抗体和尼罗红标记自噬体和脂滴。如图4C和D所示，gAcrp处理后LC3和尼罗红的共定位显着增加，表明脂联素促进了脂滴向自噬泡的传递。LysotrackerRed（溶酶体）和Bodipy493/503（脂滴）之间的重叠进一步证实了脂联素增强的自噬泡和脂滴之间的相互作用（图4E和F）。接下来，我们检查了gAcrp对细胞FFA的影响，细胞FFA是脂滴降解的主要产物之一。有趣的是，虽然在早期（长达8小时）观察到游离脂肪酸水平显着增加，但在gAcrp的长期治疗（24小时）后，该水平显着降低（图4G和H）。鉴于FFA作为能量底物的作用，我们最终验证了脂联素对脂解的激活是否会导致FAO增加。正如预期的那样，gAcrp促进了乳腺癌细胞中的FAO（图4I），表明脂联素对脂肪分解的刺激与FAO相结合。总的来说，这些研究结果表明，脂联素通过激活脂肪吞噬，诱导FFA的释放，随后被FAO降解。

脂联素在乳腺癌细胞中的脂质代谢重塑是通过SIRT-1诱导介导的

SIRT-1作为主要的细胞代谢调节剂，据报道是脂联素的下游效应物。为了阐明脂联素对脂质代谢重编程的分子机制，我们检查了SIRT-1信号传导在脂联素调节的脂质代谢中的参与。正如所料，gAcrp在MCF-7和MDA-MB-231细胞中以时间依赖性方式诱导SIRT-1表达（图5A和B）。gAcrp对SIRT-1的诱导被证明依赖于ROS的产生（图S3A和S3B）。重要的是，通过用其药理学抑制剂（EX527）治疗或用靶向SIRT-1的siRNA转染来抑制SIRT-1消除了gAcrp对SREBP-1和FASN表达的抑制作用（图5C和D）。同样，FAS基因的mRNA水平，包括FASN、ACC-1、FADS2和ACLY，通过EX527预处理（图5EE）恢复，表明SIRT-1诱导在FAS的脂联素调节中的关键作用。还值得注意的是，SIRT-1的阻断阻止了gAcrp的脂质消耗（图5F）、脂质筏破坏（图5G）和脂肪吞噬激活（图5H），进一步证实SIRT-1驱动脂质代谢重编程脂联素刺激的乳腺癌细胞。鉴于先前发现改变脂质代谢对脂联素诱导乳腺癌细胞死亡至关重要，因此设计了后续实验以确定SIRT-1在调节癌细胞命运中的意义。结果表明，gAcrp降低的细胞活力主要通过EX527或SIRT-1敲低预处理来恢复（图5I和J）。此外，如通过caspase-3/7活性（图5K）和TUNEL（图5L）测定所确定的，用EX527预处理可通过脂联素使乳腺癌细胞免于凋亡。此外，虽然发现gAcrp通过增强Bax表达和降低Bcl2水平来促进细胞凋亡，但这些调节作用被EX527拮抗（图5M）。总之，这些结果表明，SIRT-1诱导对于脂联素的脂质代谢重编程和细胞凋亡诱导是必不可少的。

SIRT-1通过SREBP-1的去乙酰化和mTOR的抑制促进脂联素的脂肪酸代谢改变

在证明SIRT-1介导脂联素的代谢作用后，我们接下来试图阐明SIRT-1诱导驱动细胞脂肪酸代谢的机制。作为一种脱乙酰酶，据报道SIRT-1可调节SREBP-1乙酰化。因此，我们推测脂联素通过SIRT-1诱导调节SREBP-1的乙酰化。因此，我们通过免疫沉淀测定法测量了MCF-7细胞中SREBP-1的乙酰化水平，发现gAcrp显着降低了乙酰化核SREBP-1的水平（图6A）。有趣的是，降低的SREBP-1乙酰化伴随着增强的泛素化SREBP-1水平（图6B），表明脂联素对SREBP-1的去乙酰化导致不稳定性并通过泛素途径促进SREBP-1的降解。SIRT-1在SREBP-1去乙酰化和降解中的作用在随后的实验中得到证实，这表明SIRT-1敲低消除了gAcrp对SREBP-1乙酰化和泛素化的影响（图6C和D）。

SREBP-1表达通过多种机制进行调节，包括涉及乙酰化的翻译后调节。为了进一步阐明潜在的分子机制，我们检查了mTOR的参与，它被称为SREBP-1在各种细胞类型中表达的调节剂。我们发现gAcrp显着抑制MCF-7（图6E）和MDA-MB-231（图6F）乳腺癌细胞中mTOR的磷酸化。通过证明mTOR的药理学抑制剂雷帕霉素显着降低SREBP-1表达（图6G），而通过治疗激活mTOR，证实了mTOR信号传导在乳腺癌细胞中SREBP-1表达中的刺激作用用MHY1485增强SREBP-1的表达水平（图6H）。观察到对FASN表达的基本相似影响（图6G和H）。一致地，MHY1485引起中性脂质的显着积累和细胞游离脂肪酸水平的提高，而雷帕霉素对MCF-7细胞中的细胞脂质含量产生相反的影响（图6I和J），共同表明mTOR的关键作用脂联素处理的乳腺癌细胞中SREBP-1表达和脂质代谢的信号传导。有趣的是，通过转染特异性siRNA或EX527抑制SIRT-1部分消除了gAcrp对mTOR磷酸化的抑制（图6K和L），这表明SIRT-1信号传导也与脂联素对mTOR活化的抑制有关.总之，这里的这些结果表明，脂联素对SIRT-1的诱导通过其成熟形式的直接脱乙酰化或通过抑制mTOR间接调节SREBP-1的表达和活性。

脂联素调节体内原位乳腺肿瘤中的脂肪酸代谢重编程和肿瘤生长

为验证脂联素在体内条件下对细胞脂肪酸代谢的调节作用以及SIRT-1信号在其代谢和抗癌作用中的作用，在BALB/c裸鼠和小鼠体内建立了原位乳腺肿瘤模型。用gAcrp和/或SIRT-1(EX527)的药理学抑制剂治疗乳腺肿瘤。我们首先通过蛋白质印迹分析（图S4A）和IHC（图S4B）证实了脂联素在肿瘤组织中的SIRT-1诱导作用。正如预期的那样，EX527消除了gAcrp对肿瘤生长的抑制作用，如通过生物发光成像和肿瘤重量测量（图7A-D）。此外，与EX527共同处理显着降低了裂解的caspase-3阳性细胞的比例（图7E）和Bax表达，但增强了gAcrp处理的肿瘤中的Bcl2水平（图7F），表明抑制SIRT-1脂联素阻止肿瘤细胞凋亡。与体外观察结果一致，gAcrp下调SREBP-1（图7G）并抑制肿瘤组织中核SREBP-1（图7H）的表达。此外，发现gAcrp可降低SREBP-1和FAS基因的mRNA水平，包括FASN、ACC1、FADS2和ACLY（图7I）。通过免疫印迹进一步验证了FASN的下调（图7G）。此外，gAcrp降低了p-mTOR和活性β-catenin的表达水平，但增加了LC3-II水平（图7J）。EX527联合治疗消除了这些影响，与体外研究结果一致，表明脂联素抑制mTOR磷酸化，下调Wnt/β-连环蛋白途径，激活自噬，并以SIRT-1依赖性方式负调节SREBP-1及其靶标.为了验证脂联素对细胞脂质稳态的体内影响，分析了肿瘤来源的乳腺癌细胞中的中性脂质和游离脂肪酸含量。结果表明，用gAcrp处理导致细胞脂质储备（图7K）和游离脂肪酸水平（图7L）显着降低，EX527显着恢复，清楚地证实了SIRT-1在脂联素促进脂质代谢的改变。

全文总结

这项研究表明，脂联素显著减少乳腺癌细胞内的脂质储存，通过抑制脂肪酸合成和激活脂肪自噬及脂肪酸氧化导致细胞凋亡，破坏脂筏结构和依赖脂筏的信号传导。此外，SIRT-1在脂联素诱导的代谢变化中起关键作用。在小鼠模型中的实验证实，脂联素的这些代谢作用和其诱导的乳腺癌细胞凋亡密切相关。这一发现为脂联素作为潜在抗癌治疗药物提供了新的见解，有助于开发新的癌症治疗策略。

原文链接：

https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13046-021-02223-y

【iMedicine】本公众号专注医学前沿动态，分享科学普及信息。欢迎关注、投稿、分享和转载，投稿或转载请联系本公众号，喜欢本文请“点赞+在看”支持一下，让医学知识更多传播出去！