引文集锦丨J Exp Clin Cancer Res：圣心大学Claudio Sette揭示NEK2在调控TNBC剪接中的作用

乳腺癌（BC）是全球女性最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因。它是一种异质性疾病，包括多种亚型，具有不同的组织病理特征、分子变化和临床进程。通过识别雌激素（ER）、孕激素（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）作为分子标志物和癌症驱动因子，使得肿瘤的精确分层和针对性治疗的开发成为可能，从而显著改善了BC患者的管理和预后。然而，约15%的BC患者为三阴性乳腺癌（TNBC），这些癌症不表达上述受体，无法从内分泌和抗HER2疗法中受益，标准化疗是TNBC患者唯一确立的治疗选择。此外，过去十年中，通过RNA测序（RNA-seq）的转录组分析在癌症研究中取得了显著突破，揭示了癌细胞的全面表达特征，并强调了曾被认为相似的肿瘤之间的显著差异。特别是，最近的数据调查显示，与正常组织相比，肿瘤显示出更广泛的转录组多样性，这主要是由于广泛的选择性剪接（AS）失调引起的。这种失调通常产生促进肿瘤发生和对治疗产生抗性的致癌变体。此外，异常剪接也可能成为可以治疗性利用的肿瘤脆弱性。例如，剪接缺陷可以创建肿瘤特异性新连接，编码特异性肽或新抗原，可用于开发抗癌免疫疗法。此外，对TNBC进行的转录组分析揭示了NEK2激酶对AS调节的广泛影响，NEK2敏感的外显子与TNBC的剪接签名重叠，以及在癌细胞进行上皮-间充质转化（EMT）期间激活的剪接程序重叠。我们的结果表明，NEK2通过调节剪接因子RNA结合蛋白狐狸-1同源体2（RBFOX2）的表达，调控促进间充质剪接程序，从而调节TNBC细胞的迁移和侵袭性。因此，我们的研究揭示了NEK2在调节TNBC转录组中的作用，暗示了这种活性与TNBC的侵袭性和转移行为有关。

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NEK2在BC中经常上调，并促进与预后不良相关的致癌特征。为了研究NEK2的高表达是否与BC亚型特别相关，我们查询了癌症基因组图谱(TCGA)中可用的原发性肿瘤和正常组织的数据。通过使用psichomics R包，我们观察到与正常乳腺组织和所有其他BC亚型相比，NEK2在TNBC中的表达明显更高（图1A，附加文件2：补充图1A，B）。与正常乳腺组织和其他BC亚型相比，TNBC中NEK2表达的上调也通过分析来自另外五个BC患者队列的数据得到证实（附加文件2：补充图1C-G）。特别是，BC患者的受体状态分层显示NEK2在ER和PR阴性肿瘤中以更高水平表达（图1B，C），而当患者被分层进行HER2扩增时未观察到显着变化（图1D)。BC亚型中NEK2表达差异的模式在很大程度上通过METABRIC项目的数据分析得到证实，尽管在该队列中观察到HER2阳性肿瘤中NEK2适度但显着上调（附加文件2：补充图1H-L)。根据这些观察结果，来自癌细胞系百科全书(CCLE)项目[35]的转录组数据分析显示，与其他BC亚型的代表相比，ER-/HER2-细胞系中的NEK2表达更高（附加文件2：补充图.1M)。计算分析通过qRT-PCR和蛋白质印迹分析得到验证，证实了代表性TNBC细胞系中NEK2转录物和蛋白质相对于其他BC亚型的水平更高（图1E；附加文件2：补充图1N）。此外，我们发现，虽然NEK2的消耗降低了TNBC（MDA-MB-231）和ER+/PR+BC细胞的生长速率，但它对TNBC细胞的影响要强得多（图1F，附加文件2：补充图1）。1O)。总的来说，这些结果表明NEK2在TNBC中具有特别相关的作用。

NEK2对TNBC转录组的全基因组调控

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癌细胞中的NEK2上调以前与其在细胞核中的定位有关。因此，我们分析了NEK2在显示不同激酶表达的BC系中的亚细胞分布。为此，我们选择MCF-7、ZR-75-1作为ER+/PR+ BC细胞，选择MDA-MB-468和MDA-MB-231作为异质TNBC细胞组中不同基础亚型的代表。分级实验表明，除了预期的细胞质定位外，大部分NEK2存在于TNBC细胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-468）的核质和染色质区室中，其中剪接因子如SRSF1和异质核核糖核蛋白F和H(hnRNPF/H)也被定位（图2A）。相比之下，NEK2主要位于ER+/PR+BC细胞（MCF-7、ZR-75-1）的细胞质中（图2A）。免疫荧光分析证实了NEK2在MDA-MB-231细胞核区室中相对于MCF-7细胞的更高富集（图2B，附加文件2：补充图2）。这些观察结果表明，NEK2在TNBC细胞中增加的核定位可能有利于其剪接调节活性。

为了研究NEK2表达是否调节TNBC细胞的转录组，我们敲低了它在MDA-MB-231（附加文件2：补充图3A）中的表达，MDA-MB-231是一种代表侵袭性TNBC的细胞系。对富含多聚腺苷酸的RNA的双端高通量测序分析揭示了NEK2对MDA-MB-231细胞转录组的广泛调节。比较生物信息学分析确定了在表达水平调节的2059个基因和在剪接水平调节的1211个基因，两组之间有显着但有限的重叠（图2C和附加文件3：补充表3-5）。这些结果表明NEK2对TNBC细胞转录组的多层次影响。在对NEK2表达敏感的1830个AS事件中，外显子盒（20.2%）和末端外显子（14.6%）是最具代表性的剪接模式（图2D）。我们还检测到很大一部分替代的第一外显子事件（17.9%），这可能反映了不同的启动子选择。连同大量表达调节基因，这一发现表明NEK2可能影响TNBC细胞中关键转录因子的表达或活性。鉴于剪接失调在TNBC中的新兴作用，我们专注于NEK2对AS的影响。通过RT-PCR对14个事件的分析证实了RNA-seq在MDA-MB-231细胞中鉴定的剪接变化（图2E和附加文件2：补充图3A、C）。此外，它们中的大多数（~86%；n=14）也对另一个TNBC细胞系中的NEK2消耗敏感（SUM159；图2E，附加文件2：补充图3B，C）。这些观察结果强烈表明NEK2表达通过调节AS调节影响TNBC细胞的转录组。

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接下来，我们询问NEK2调节的AS事件是否有助于区分TNBC原发性肿瘤与其他BC亚型的剪接特征。在我们的参考FASTDB数据库中注释为已知“模式”的NEK2调节的替代事件的分析表明，盒外显子的频率大大超过了它们在基因组中的表现所预期的频率（附加文件2：补充图4A）。此外，使用psichomics R包分析TCGA数据集指出外显子盒是TNBC和其他BC之间差异调节的AS事件中最具代表性的剪接模式（附加文件2：补充图4B；附加文件4：补充表6）。因此，我们专注于外显子盒模式，并进一步选择了在我们的参考FASTDB数据库和psichomics中通常注释的139个事件。有趣的是，我们发现NEK2敏感盒外显子与TNBC和“其他BC”组之间差异剪接的外显子之间存在显着重叠（图3A，附加文件4：补充表7）。在大多数情况下，NEK2促进了TNBC特异性变体，并且它在MDA-MB-231中的沉默将剪接模式恢复到在“其他BC”患者组中观察到的剪接模式（图3B）。对其他BC（MCF-7、ZR-75-1）和TNBC（SUM159、MDA-MB-231）亚型的代表性细胞系的RT-PCR分析证实了这些盒式外显子包含的差异模式（图3C、D）。此外，五种不同TNBC细胞系中NEK2的消耗始终促进在“其他BC”患者和细胞中观察到的剪接模式（图3E；附加文件2：补充图2C和补充图4C）。总的来说，这些观察结果表明TNBC中NEK2表达的上调有助于建立其特定的剪接特征。

NEK2调节两侧是低GC内含子的弱盒式外显子

为了研究NEK2的剪接调控机制，我们首先探索了受调控的盒式外显子的结构和序列特征。与参考替代外显子和组成型外显子相比，NEK2敏感外显子的特征是5'和3'剪接位点特别弱（图4A）。此外，与盒和组成型外显子相比，它们显示出更长和更强的聚嘧啶束（图4B），因此分支点和3'受体剪接位点之间的距离更大（图4C）。后一种特征被证明富含特别弱的外显子，这些外显子更容易被跳过。与其他参考盒外显子一样，NEK2调节的外显子的特征在于与组成型剪接外显子相比，GC含量较低（图4D）。然而，即使与其他盒式外显子相比，它们的两侧也有具有较低GC含量的内含子（图4D）。有趣的是，最近显示外显子和侧翼内含子序列中较低的GC含量是替代外显子的特定特征，其包含依赖于U2snRNP相关蛋白。这些分析表明，NEK2通过调节特定RNA结合蛋白(RBPs)的表达或活性来发挥其剪接作用，RBPs作为弱外显子的激活剂或阻遏物，两侧是低GC含量的内含子。

RBFOX2结合基序在NEK2敏感盒外显子中富集

为了鉴定可能参与NEK2剪接调节功能的RBP，我们搜索了与非调节盒式外显子和组成型外显子相比，富含NEK2调节外显子和侧翼内含子的RNA基序。发现五个序列基序在NEK2调节的外显子的基因组区域中显着富集（附加文件2：补充图5A），CATGCAD是最重要和最丰富的序列元素（图5A）。CATGCAD基序在上调（64.6%）和下调（67%）外显子两侧的序列中以显着更高的比例存在（图5B）。此外，两种类型的外显子的特征还在于参考盒外显子和组成型外显子的基序数量更多（图5C）。然而，该基序的分布在以相反方式调节的外显子中是不同的，其富集位于NEK2下调外显子的下游和NEK2上调外显子的上游或内部（图5D）。这种模式暗示了同源剪接因子的位置调节作用。

接下来，通过使用Tomtom比较工具，我们筛选了已知RBP的概要，以了解它们对CATGCAD基序的潜在亲和力。值得注意的是，CATGCAD基序与已知以位置依赖性方式起作用的剪接因子的结合位点表现出最高的相似性，例如RBFOX1-3、RNA结合基序蛋白6(RBM6)、hnRNPL和肌肉盲样剪接调节器1(MBNL1)(图5E)。在显示出与基序结合最显着潜力的RBFOX蛋白中（图5E），我们将注意力集中在RBFOX2上，因为来自CCLE项目的转录组数据显示RBFOX1和3在我们的参考模型、MDA-MB-231细胞和其他ER-/HER2-BC细胞系（附加文件2：补充图5B）。有趣的是，RBFOX2表达水平还与TNBC患者转录组中NEK2调节外显子的最高数量相关（图5F），并且对于其中大多数（94.2%）而言，其方式与NEK2的积极作用一致关于RBFOX2功能。实际上，与患者RBFOX2表达正相关的事件在NEK2耗尽的MDA-MB-231细胞（即MYO18A的外显子48；图5G）中下调，而与患者RBFOX2负相关的事件在NEK2中上调-耗尽的MDA-MB-231细胞（即ATP5C1；图5H）。由于已知RBFOX2在下游内含子中结合时促进外显子包含，而在上游内含子或外显子内结合时抑制外显子，这些分析与耗尽后其剪接活性受损的假设一致NEK2的。

NEK2调节TNBC细胞中RBFOX2依赖性前间充质剪接程序

对基因表达变化的RNA-seq数据的分析表明，RBFOX2表达是NEK2沉默细胞中唯一受调控的CATGCAD基序结合RBP（附加文件2：补充图6A）。此外，来自多个ER-/HER2-BC细胞系的数据集的计算分析揭示了NEK2和RBFOX2的表达水平之间的显着相关性（图6A）。因此，在NEK2耗尽的MDA-MB-231细胞中，RBFOX2在转录物和蛋白质水平上均显着下调（图6B-D）。NEK2耗尽细胞中的RBFOX2下调不是由转录物稳定性降低来确定的，如分析它在转录抑制后的表达表明RBFOX2转录物的衰减没有变化，相对于像MYCmRNA这样的高周转转录物相对稳定（附加文件2：补充图6B）。这一观察结果表明NEK2敲低抑制了RBFOX2mRNA的转录。值得注意的是，这种效应似乎是特异性的，因为没有观察到hnRNPL表达的显着变化（图6C，D），它被选为与高比例的NEK2调节的外显子相关的另一个RBP（图5F）。

为了检验RBFOX2调节NEK2敏感外显子剪接的假设，我们沉默了它在MDA-MB-231细胞中的表达。除了SPTAN1外显子24外（附加文件2：补充图7A），所有其他任意选择的盒式外显子都通过RBFOX2或NEK2耗尽沿相同方向调制，在大多数情况下，当RBFOX2被敲除时，倍数变化更大下（图6E；附加文件2：补充图7A）。另一方面，hnRNPL的消耗仅轻微影响少数事件（图6E；附加文件2：补充图7A）。重要的是，NEK2在另一种间充质TNBC细胞系(MDA-MB-436)中正向调节RBFOX2的表达，并且NEK2依赖性剪接事件也对这些细胞中的RBFOX2消耗敏感（附加文件2：补充图7B-D）。

RBFOX2的剪接活性显示在上皮间质转化(EMT)期间驱动剪接变化并促进BC细胞中的前间充质程序。值得注意的是，我们观察到由NEK2调节的盒式外显子与先前研究中鉴定的上皮和间充质BC细胞和组织之间差异表达的外显子之间存在高度显着的重叠（图6F，附加文件4：补充表8）。该比较分析还显示，NEK2消耗抑制了这27个剪接事件中的大多数（92.5%；图6G）中的间充质富集模式。此外，上皮细胞（HCC1937）和间充质（MDA-MB-231）TNBC细胞之间任意选择的EMT相关事件的比较证实了这些外显子的差异包含以及NEK2对促进间充质剪接模式的影响（图6H和其他文件2：补充图7E)。此外，Western印迹分析证实了在NEK2耗尽的间充质TNBC细胞中富含上皮的NF-YA转录因子短同种型的表达增加（图6I），从而验证了蛋白质水平的剪接开关。这些结果表明NEK2通过调节RBFOX2的表达和活性促进TNBC细胞中的前间充质剪接模式。

NEK2诱导的剪接变体促进TNBC细胞的间充质表型

由NEK2在剪接水平调节的基因的功能注释揭示了与细胞粘附和收缩细胞骨架相关的术语的显着丰富（图7A）。这些过程在癌细胞的EMT期间受到广泛调节，并促进疾病向转移阶段的进展。值得注意的是，EMT失调使TNBC具有侵袭性和转移性表型。因此，我们询问NEK2调节的盒式外显子的包含水平是否可以分离具有不同临床结果的TNBC患者。对来自TCGA的关于无复发生存期(RFS)或总生存期(OS)概率的可用数据的分析确定了24个NEK2敏感盒外显子，这些外显子在TNBC患者中具有预后意义，并且NEK2促进了与较差预后相关的剪接模式（图.7B，附加文件2：补充图8A)。此外，我们观察到NEK2调节的外显子与识别基底B样患者的最小剪接特征之间存在高度显着的重叠（附加文件2：补充图8B）。这些计算分析表明，NEK2调节的剪接程序在TNBC细胞中是致癌的。为了进一步证实这一假设，我们研究了调节由NEK2调节的特定剪接异构体的表达水平的功能后果：MYO18A外显子48+、SORBS1外显子12+、SPAG9外显子30+。TNBC细胞中的NEK2促进了这三个外显子的包含（图7C），并且与TNBC患者的较差预后相关（图7B）。外显子特异性siRNA的转染能够特异性下调NEK2诱导的剪接变体，而不影响这些基因的替代同种型（图7C；附加文件2：补充图8C）。细胞骨架1的鬼笔环肽染色揭示了在敲除NEK2后MDA-MB-231细胞的显着形态变化，间充质细胞的典型细长形状丧失并获得立方形的上皮样表型（图7D）。值得注意的是，通过同时靶向NEK2诱导的MYO18A、SORBS1和SPAG9基因的剪接变体实现了相同的效果（图7D）。与观察到的形态学变化一致，qRT-PCR分析揭示了编码与TNBC预后不良相关的间充质标志物的转录物的下调，例如膜蛋白钙粘蛋白11(CDH11)、细胞骨架波形蛋白(VIM)和两者关键转录因子锌指E-box结合同源框1（ZEB1）和2（ZEB2）（图7E）。还通过蛋白质印迹分析在蛋白质水平评估了波形蛋白表达降低，MDA-MB-231细胞耗尽了NEK2或其靶剪接变体，而上皮标志物E-钙粘蛋白(CDH1)的水平略有增加仅在NEK2沉默的细胞中观察到（图7G）。这些观察结果支持MYO18A、SORBS1和SPAG9基因的NEK2敏感剪接变体在该激酶促进的前间充质程序中的功能参与。

此外，NEK2或三种“间充质”剪接变体的敲低损害了MDA-MB-231细胞的迁移特性，如伤口愈合和基质胶侵袭试验的结果所示（图8A-D）。总的来说，这些观察结果表明NEK2通过协调前间充质剪接程序来促进TNBC细胞的迁移和侵袭表型。

全文总结

这项研究发现，NEK2激酶在三阴性乳腺癌（TNBC）细胞中的表达异常增高，并在细胞核内通过调节剪接因子RBFOX2，影响肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。通过分析TNBC细胞中NEK2的作用，研究揭示了其在调控肿瘤特异性选择性剪接中的关键角色，这一发现为开发针对TNBC的新治疗策略提供了潜在的分子靶点。

原文链接：

https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13046-021-02210-3

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