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聚合酶链反应（PCR，Polymerase Chain Reaction） 是由Kary Mullis于1985年发明的用于体外扩增特定DNA片段的技术。PCR通过模拟体内DNA复制过程，依赖于热循环和耐热的DNA聚合酶，可以将微量DNA模板扩增至足以用于分析的数量。随着技术的进步，PCR发展出了多种衍生方法，包括普通PCR、实时定量PCR（qPCR）、逆转录PCR（RT-PCR）、实时逆转录定量PCR（RT-qPCR）和数字PCR（dPCR）。以下是这些技术的详细介绍。
本文主要内容
普通PCR
实时荧光定量PCR(qPCR)
逆转录PCR(RT - PCR)
实时荧光定量逆转录PCR(RT-qPCR)
数字PCR(dPCR)
普通PCR
普通PCR的工作流程通过一系列温度变化循环来扩增DNA，主要步骤如下：
变性（Denaturation）：将反应体系加热至 94-95℃，使DNA的双螺旋解开成为两条单链，这一过程通常持续30秒到1分钟。退火（Annealing）：将温度降低至 50-65℃，使设计好的引物与单链DNA模板的互补序列结合。退火温度的精确选择至关重要，过低的温度会导致非特异性结合，而过高则可能使引物无法有效结合。退火时间通常为30秒。延伸（Extension）：在 72℃的条件下，由Taq DNA聚合酶沿着引物方向合成新的DNA链，使用dNTP作为原料。延伸时间取决于目标DNA的长度，通常按照每1000 bp约1分钟的速度进行。
经过25-35个循环后，特定的DNA片段会被指数级扩增。PCR的扩增效率受多种因素影响，如引物设计、模板纯度和聚合酶的质量。
优点:
技术成熟：普通PCR技术经过多年的发展，已经非常成熟，操作流程明确。 通用性强：适用于大多数DNA扩增需求，应用广泛。 成本较低：试剂和设备相对便宜，适合大多数实验室使用。
缺点:
非特异性扩增：容易发生非特异性扩增和引物二聚体，可能导致假阳性结果。 操作繁琐：需要后续的凝胶电泳分析，增加了实验的复杂性和时间。 定量分析能力有限：普通PCR无法提供关于DNA量的定量信息。
普通PCR在分子生物学的许多实验中都具有广泛应用，主要包括：
基因克隆与突变检测：PCR可用于扩增特定基因片段，随后进行克隆或通过定向突变技术修改目标序列。PCR扩增的片段可以进一步用于质粒载体构建。 遗传多样性分析：通过扩增微卫星序列或短串联重复序列，普通PCR常用于个体识别、亲子鉴定和种群遗传学研究。 病原体检测：普通PCR可在临床样本中检测病原体的存在，例如细菌或病毒DNA的存在。
实时荧光定量PCR(qPCR)
实时定量PCR（qPCR）不仅能够扩增特定的DNA序列，还可以通过荧光染料或探针实时监测产物的积累情况，从而实现对目标DNA的精确定量。实时荧光信号可以在PCR的每个周期后记录，常用的荧光检测方法包括：
SYBR Green法：使用SYBR Green荧光染料与双链DNA结合。每当新合成的双链DNA形成时，SYBR Green结合到DNA上并发出荧光。荧光信号的强度与扩增的DNA量成正比。该方法相对简单且成本低廉，但可能检测到非特异性产物，如引物二聚体。
TaqMan探针法：TaqMan探针是一种特异性很高的荧光探针，含有荧光报告基团和淬灭基团。当探针结合到目标DNA上时，Taq DNA聚合酶会在扩增过程中降解探针，释放出报告基团，发出荧光。与SYBR Green法相比，TaqMan探针法具有更高的特异性，但成本较高。
qPCR通过分析扩增曲线的Ct值（循环阈值），即检测到荧光信号显著增加时所需的循环次数来推算目标DNA的起始数量。Ct值与样品中的初始模板量成反比，模板量越高，Ct值越低。
优点:
高灵敏度：可以检测到低拷贝数的目标DNA，适用于精确的定量分析。 特异性强：尤其是TaqMan探针法，具有较高的特异性，能够减少假阳性结果。 实时监测：能够在PCR反应的每个周期实时监测DNA扩增情况，无需后续的凝胶电泳分析。
缺点:
成本较高：尤其是使用TaqMan探针法时，试剂和设备成本较高。 操作复杂：需要精确的试剂配比和反应条件优化，操作复杂度增加。 SYBR Green法的特异性较低：可能会产生假阳性结果，特别是在存在非特异性扩增时。
qPCR被广泛应用于定量分析，包括：
基因表达定量分析：通过检测cDNA来定量分析特定基因在不同条件下的表达水平。例如，qPCR常用于分析疾病状态下基因表达的上调或下调。 病毒载量检测：qPCR能够准确地检测和定量病毒DNA/RNA的水平，例如用于HIV、HBV等病毒载量监测。 拷贝数变异检测：通过分析不同样本中基因的拷贝数变化，qPCR能有效检测基因组中某些基因的扩增或缺失情况。
逆转录PCR(RT - PCR)
逆转录PCR（RT-PCR）专为检测RNA设计，它通过逆转录酶将RNA转化为cDNA，再利用PCR扩增cDNA片段。RT-PCR的两步法和一步法区别如下：
两步法：首先在单独的反应中使用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，然后将cDNA用作PCR的模板扩增特定基因片段。这种方法灵活性较高，适合多基因的检测。 一步法：逆转录和PCR反应在同一试管中进行，反应更加简便和快速，适合高通量实验。
RT-PCR依赖于逆转录酶的有效性和RNA的纯度，RNA样品容易被RNase降解，因此RNA提取与处理过程中需特别注意。
优点:
高灵敏度：能够检测到低丰度的RNA，适用于基因表达的定性分析。 适用范围广：适用于mRNA、总RNA及体外转录的RNA产物的分析。 一步法便捷：一步法简化了实验流程，减少了操作时间和样品处理步骤。
缺点:
定量能力有限：传统RT-PCR只能提供定性的结果，无法进行精确的RNA量化。 RNA易降解：RNA样品容易受到RNase降解，需在严格控制的条件下操作。 技术要求高：对逆转录酶的选择和操作条件要求较高。
RT-PCR广泛用于基因表达研究和RNA病毒检测，主要应用包括：
基因表达分析：用于检测细胞或组织中特定基因的mRNA水平。例如，通过RT-PCR可以研究在不同发育阶段或外界刺激下基因表达的变化。 RNA病毒检测：RT-PCR是检测RNA病毒（如流感病毒和SARS-CoV-2）的金标准技术，特别是在疫情暴发期间用于快速诊断。
RT-PCR的局限性在于它只能提供定性的结果，而无法提供精确的定量信息。
实时荧光定量逆转录PCR(RT-qPCR)
RT-qPCR结合了RT-PCR的逆转录步骤和qPCR的实时定量功能，用于精确定量RNA分子。首先通过逆转录酶将RNA转录为cDNA，随后在实时PCR扩增中，利用荧光信号监测DNA的积累量。通常，RT-qPCR的荧光检测方法与qPCR相同，包括SYBR Green法和TaqMan探针法。
优点:
精确定量：能够对RNA进行精确的定量分析，适合动态研究基因表达水平。 高灵敏度和特异性：结合了qPCR的优势，能够检测低丰度RNA并提供准确的定量结果。 实时监测：在PCR反应过程中实时监测，减少了对后续分析的需求。
缺点:
操作复杂：需要优化反应条件，操作过程较为复杂。 成本较高：试剂和设备成本相对较高，特别是使用高特异性探针时。 样品处理要求高：对RNA的处理要求严格，需要避免RNase污染。
RT-qPCR的应用与qPCR类似，但其特有优势在于能够精确定量RNA样品中的目标基因。常见应用包括：
RNA病毒载量检测：如COVID-19病毒的载量检测，实时逆转录定量PCR可以精确地测定患者样本中病毒RNA的数量。 基因表达动态分析：在生物学实验中，通过RT-qPCR可以定量研究不同条件下基因表达的动态变化。
该技术的优势是高灵敏度和精确度，但对设备、试剂和操作流程的要求较高。
数字PCR(dPCR)
数字PCR被称为第三代PCR技术，它是一种核酸分子绝对定量(直接定量更准确一些)技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量，可针对核酸分子做更精确的定量分析。其创新之处在于， PCR反应体系经过微滴制备可将目标分子DNA或RNA样品分割至数千到数万个独立的反应单元中，然后对众多微反应单元内的靶序列进行单分子模板 PCR 扩增，实现“单分子模板PCR扩增”。扩增结束后含有目标分子模板的单元会发出荧光信号，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出目的分子的浓度或拷贝数。目前的数字PCR技术在病原体筛查、NIPT检测、肿瘤突变检测等方向已得到广泛应用。
相较于第一代普通PCR和第二代qPCR，数字PCR具有以下优势：
优点： 无需标准曲线即可对目标分子进行绝对(凡事无绝对，直接更准确)定量；测试结果可直接给出样本具体的
浓度/拷贝数，而非CT值；(抑制剂)耐受性强，通过把模板分散到各个反应微单元，能够有效降低抑制剂对扩增的影响，可以实现单分子PCR扩增，非常利于复杂样本和突变样本的检测，具有比传统荧光定量 PCR 更加出色的灵敏度和精确性；可通过荧光编解码实现多重/超多重PCR检测。缺点： 需要根据不同的模板序列，合成不同的探针；成本相对较高。
主要参考：
[1]. https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=Mzk0MzY0ODc2Nw==&mid=2247483804&idx=1&sn=b32ab270b77318e52dc15be634a95077&chksm=c331fb0cf446721ae8aa6271260afc601a0b07c25352c0b865bc0bdb58ea386a3d9730241b66&token=12961097&lang=zh_CN#rd
[2]. https://blog.sciencenet.cn/blog-3536222-1447409.html
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