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文章信息
论文题目： POLQ plays a key role in the repair of CRISPR/Cas9-induced double-stranded breaks in the moss Physcomitrella patens
中文标题： POLQ 在修复 CRISPR/Cas9 诱导的小立碗藓 (Physcomitrella patens) 双链断裂中发挥关键作用
关键词： alternative end joining (Alt-EJ), CRISPR-Cas9, gene targeting, Physcomitrella patens, polymerase Q (POLQ).
作者： Kostlend Mara, Florence Charlot, Anouchka Guyon-Debast, Didier G. Schaefer, Cecile Collonnier, Mathilde Grelon and Fabien Nogue
发表日期： 2019
期刊： New Phytologist
影响因子： 9.3
DOI: https://doi.org/10.1111/nph.15680
中文摘要
双链断裂可以通过不同的修复机制，如同源重组(HR)、经典非同源末端连接(C-NHEJ)和替代末端连接(Alt-EJ)。聚合酶Q(POLQ)被认为是Alt-EJ介导的DNA修复的主要因素
在这里，作者描述了POLQ在Physcomitrella patensDNA修复和基因打靶中的作用。POLQ基因的突变不会影响Physcomitrella patens的遗传稳定性，也不影响其发育
polq突变体对大多数基因毒性物质(紫外线(UV)、甲磺酸甲酯(MMS)和顺铂)表现出与野生型相同的敏感性，但博莱霉素除外，它对野生型的敏感性低于野生型。此外，我们还发现POLQ参与了CRISPR-Cas9诱导的双链断裂的修复。我们还证明POLQ是HR修复途径的潜在竞争者和/或抑制物。
这一发现在基因工程方面产生了影响，因为在没有 POLQ 的情况下，基因靶向的频率显着增加，并且干净的两侧 HR 介导的插入的数量增加。因此，控制植物中的 POLQ 活性可能是优化植物育种基因组工程工具的有用策略。
研究意义
DNA双链断裂（DSB）修复机制
DNA双链断裂（DSB）是细胞内的严重损伤，可以通过多种机制进行修复，包括同源重组（HR）、经典非同源末端连接（C-NHEJ）和替代末端连接（Alt-EJ）。HR是一种依赖于同源DNA序列的精确修复机制，而C-NHEJ是一种不依赖于同源序列的快速修复途径。Alt-EJ则是一种依赖于短微同源序列的高突变性修复途径。本文重点研究了Alt-EJ途径中的关键因子POLQ及其在小立碗藓（Physcomitrella patens）中对CRISPR/Cas9诱导的DSB修复的作用，及其对基因编辑效率的影响。
POLQ在DSB修复中的作用
POLQ是一种低保真度的DNA聚合酶，具有越位延伸活性，被认为是Alt-EJ途径的关键因子。该研究旨在揭示POLQ在小立碗藓中对CRISPR/Cas9诱导的DSB修复的具体作用，并探讨其对基因靶向效率的影响。通过揭示这些机制，研究者希望找到提高植物基因编辑效率的新方法。
研究方法
植物材料和转化
实验使用小立碗藓Gransden株系，在PpNH4培养基中培养植物，并通过CRISPR/Cas9技术敲除POLQ基因，生成polq突变体。植物在24℃的条件下，16小时光照/8小时黑暗循环中生长。使用传统的方法分离和转化原生质体，通过筛选抗生素抗性来选择突变体。
基因鉴定和DNA提取
通过利用人类POLQ序列在小立碗藓基因组中进行同源性搜索，识别出小立碗藓的POLQ基因。然后通过PCR和RT-PCR分析确认该基因的外显子/内含子结构，并提取基因组DNA和cDNA进行后续分析。
用于 POLQ 和 Lig4 基因敲入的 sgRNA 和质粒盒的设计和合成
设计特异性sgRNA，靶向敲除POLQ基因，并构建表达载体。这些载体包括了P. patens U6 snRNA启动子和sgRNA序列。通过CRISPR/Cas9技术生成polq突变体，并利用hygromycin抗性基因筛选成功的突变体。
基因表达分析
通过RT-PCR分析POLQ基因在突变体中的表达情况。提取总RNA，反转录合成cDNA，并使用特定引物进行PCR扩增，确认POLQ基因在突变体中的缺失情况。
自发突变频率与基因毒性敏感性测试
通过测量APT基因自发突变频率来评估遗传稳定性。使用2-氟腺嘌呤（2-FA）筛选自发突变体。测试突变体对不同DNA损伤剂（如UV-B、MMS和顺铂）的敏感性，比较polq突变体和野生型对这些基因毒性剂的反应差异。
CRISPR/Cas9诱导DSB和基因靶向实验
评估在有和没有供体模板的情况下，CRISPR/Cas9诱导的DSB修复效率和类型。通过转化含有Cas9和特定sgRNA的质粒，诱导APT基因的DSB，使用2-FA筛选突变体，并测定突变频率和类型。
研究结果
polq 突变体的发育和遗传稳定性没有改变
分析了源自几个突变株系孢子的克隆在整个生命周期中的表型，并确认 polq 突变体显示出与野生型相同的原丝体和配子体。在 polq 突变体和野生型的 5×10^6 个原生质体衍生的菌落中，我们没有观察到任何自发突变体。这些结果表明，POLQ 蛋白的丢失不会导致 P. patens 中显着的突变表型。
polq 突变体与野生型一样对 UV-B、MMS 和顺铂敏感，但对博来霉素更具抵抗力
为研究 POLQ 在对不同 DNA 损伤剂的耐药性/敏感性中的作用。对两个独立的 polqdis#2 和 polqΔ#1-1 突变体以及野生型进行了基因毒性测试。结果表明，在 P. patens 中，POLQ 不参与或仅在由这些类型的 DNA 损伤剂诱导的 DNA 损伤的修复中发挥很小的作用。
进一步研究了突变体对 DSB 诱导剂博莱霉素的敏感性。polq 突变体对博莱霉素与野生型相比，polq 突变体的 LD50 比野生型高三倍（Figure 3）。为了检查这一特征是否是受 C-NHEJ 影响的小叶小蠹突变体所共有的，我们测试了 lig4 突变体对博来霉素的敏感性。与polq突变体相比，lig4突变体对博来霉素比野生型更敏感（Figure 3）。
polq 突变体中 CRISPR 诱导的突变率和基于 Alt-EJ 的 DSB 修复降低
为了研究 POLQ 在 P. patens 修复 DSB 中的作用，作者比较了 CRISPRCas9 诱导的 DSB 修复的效率和性质。结果表明 CRISPR-Cas9 诱导的 DSB 的重要部分通过 C-NHEJ 得到了正确修复。此外，数据表明，POLQ 参与了 P. patens 中 DSB 的 Alt-EJ 修复，Alt-EJ 和 C-NHEJ 途径参与了这种苔藓中诱导 DSB 的修复，并且 Alt-EJ 修复是突变的主要来源。。
在存在供体模板的情况下，CRISPR 诱导的 DSB 在 polq 突变体中主要通过 HR 修复
在供体 DNA 存在的情况下，CRISPR 诱导的 DSB 可以通过 HR 或 NHEJ（C-NHEJ 或 Alt-EJ）进行修复。结果表明，通过 GTF 和 HRF 增强，polq 突变体中的 GTE 显着增加。POLQ 和 Alt-EJ 途径是导致 P. patens 中 靶向基因插入（TGI） 机制的重要因素。
主要结论
POLQ在小立碗藓中是Alt-EJ修复途径的关键因子，其缺失会显著增加HR修复频率。这表明，通过抑制POLQ活性，可以显著提高植物基因编辑工具的效率，特别是对于那些适合直接基因转移的植物物种。
注：
图片源自原文
个人阅读笔记。水平有限，如有错误，欢迎指正。
