西班牙农业基因组学研究中心(CRAG) 分子遗传学系Ana I. Caño-Delgado和比利时根特大学植物生物技术与生物信息学系Laurens Pauwels为文章通讯作者，Juan B. Fontanet-Manzaneque为文章一作。
原文链接：https://doi.org/10.1111/tpj.17101
一、研究背景
该文献聚焦于提高高粱和玉米的遗传转化效率，这是作物遗传改良和分子育种中的关键步骤。传统的遗传转化方法往往效率低下，限制了基因功能研究和作物改良的进展。因此，研究者们一直在探索更为高效、可靠的转化方法。
二、研究目的
本文旨在通过采用三元载体系统结合形态发生调节因子，来提高高粱和玉米的遗传转化效率，并验证该方法在产生可育转基因植株方面的有效性。
三、研究方法
载体构建：研究者构建了特定的三元载体系统，该系统能够携带目的基因以及必要的选择标记和调控元件。
形态发生调节因子的应用：为了促进细胞分化和器官形成，研究者引入了形态发生调节因子，如BABY BOOM和WUSCHEL2等。
遗传转化：采用农杆菌介导的遗传转化方法，将构建好的三元载体系统导入高粱和玉米的受体细胞中。
转化效率评估：通过统计转化成功的细胞或植株数量，来评估转化效率。同时，还分析了转基因植株的遗传稳定性和表达特性。
四、研究结果
高粱转化效率的提高：通过采用三元载体系统结合Bbm和Wus2形态发生调节因子，研究者成功地将转化效率提高了数倍。与传统方法相比，新方法不仅能够产生更多的转化体，而且转化体的遗传稳定性也更高。
玉米转化效率的提高：在玉米中，研究者同样采用了三元载体系统和形态发生调节因子进行遗传转化。结果表明，新方法的转化效率显著提高，且产生的转基因植株具有较高的可育性。此外，研究者还发现，通过优化转化条件和选择标记等参数，可以进一步提高转化效率。
图1. GUS染色愈伤组织并定量以优化侵染条件。（A-H）GUS染色愈伤组织在不同pH、光密度和温度条件下。（A）pH 5.2、OD 0.3和21°C。（B）pH 5.8、OD 0.3和21°C。（C）pH 5.2、OD 0.7和21°C。（D）pH 5.8，OD 0.7，21°C。（E）pH 5.2、OD 0.3和24°C。（F）pH 5.8、OD 0.3和24°C。（G）pH 5.2、OD 0.7和24°C。（H）pH 5.8、OD 0.7和24°C。（I，J）在pH 5.8下生长的愈伤组织的GUS染色百分比中的GUS定量。不同的字母代表统计差异。（K）GUS染色愈伤组织的最佳侵染条件（pH:5.8，24℃，OD:0.3，3天）。
图2. 载体pG3K-WO-AG的示意图和组织培养流程。（A）使用形态发生调节因子、ABA诱导的MoCRE和nptII作为选择标记的基于切除的载体构建。（B）1.3至2.15毫米的分离未成熟胚胎。侵染后7、14和21天，GUS染色愈伤组织。（C）侵染后7天在静止培养基中诱导愈伤组织。值得注意的是，未成熟胚胎的盾片中形成了胚性和非胚性组织（ET和NET）。（D） 侵染后14天，在成熟I培养基中诱导体细胞胚胎发生。已经存在球型胚（GE）和盾片胚（SE），其中存在GUS表达。（E）侵染后21天和盒式切除前，体细胞胚胎在成熟I培养基中成熟。存在胚芽鞘胚胎（CE），表达GUS的细胞团较大。（F-H）侵染后36天和66天，在感兴趣的基因盒中过表达膜蛋白的愈伤组织的详细图片。（F） 侵染后36天，体细胞胚胎在成熟II培养基中发芽。（G，H）侵染后66天，在生根培养基中生根。
图3. 基于切除的Tx430高粱转化方案流程图。
表1. 高粱转化方案中的转化效率、脱靶频率和切除效率。
图4. 整合了膜蛋白-GFP融合的转基因植株和非转基因植株的表型和共聚焦成像图片。在携带形态发生调节盒（B）、不携带形态发生调控盒（C、D）和逃逸（A）的高粱转基因植株中观察到的表型。（E，F）黄色通道（GFP）显示膜定位蛋白的定位，灰色通道（亮场）显示根组织。（E）非转基因根分生组织中GFP的缺失。（F）转基因根分生组织中GFP的存在。图像在FV1000奥林巴斯共聚焦显微镜中采集。
图5. 利用pVS1-VIR2与ZmBbm和ZmWUS2组合对玉米自交系B104进行转化。（A，B）共培养7天后，用含有pVS1-VIR2的LBA4404和二元载体pG3K-ZmUbipro::GUS-intron:tBdUBI1-C（A）和pG3K-WO-ZmUbipro::GUS-intron::tBdUBI1-C（B）转化的未成熟玉米胚胎进行GUS表达染色，以观察瞬时转化和体细胚的形成。比例尺：1毫米。（C、D）在含有G418的成熟培养基上再生的玉米植株的代表性图像。用（C）pG3K ZmUbipro:：GUS-intron::tBdUBI-C或（D）pG3K WO-ZmUbipro::GUS-intron::tBd UBI-C转化的同一玉米芯的胚胎。（E）使用pG3K WO ZmUbipro::GUS内含子：tBdUBI1-C产生的代表性转基因植株（953-552-O），自交后有穗轴图像（插图），说明正常生育能力。
图6. 高粱和玉米中T-DNA拷贝数和切除效率对再生植株的分布。通过数字PCR分析，再生植株的分布根据T-DNA拷贝数显示。类别为0、1、2、3和4或更多，高粱Tx430中T-DNA拷贝数的最大值为8，玉米B104中为5该图还显示了具有一个T-DNA拷贝的再生植株的分布，其中存在MoCRE基因。
五、研究意义
推动了作物遗传改良的进展：高效的遗传转化方法为作物基因功能研究和遗传改良提供了有力的工具。通过导入有益基因或修饰不良基因，可以培育出具有优良性状的新品种。
促进了分子育种技术的发展：该文献所描述的三元载体系统和形态发生调节因子的应用，为分子育种提供了新的思路和方法。这些技术可以与其他育种技术相结合，形成更为完善的育种体系。
六、结论与展望
该文献通过采用三元载体系统结合形态发生调节因子，成功提高了高粱和玉米的遗传转化效率。这一成果为作物遗传改良和分子育种提供了有力的支持。未来，研究者可以进一步探索其他形态发生调节因子的应用以及优化转化条件等方面的工作，以期获得更高的转化效率和更好的转基因植株性状。同时，也可以将该技术应用于其他作物中，以推动整个作物遗传改良领域的进步。
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