PBJ | 利用植物细胞代谢工程高效合成具有重要医用价值的生物碱

学术   2024-11-25 08:35   湖北  

羽扇豆的蛋白质作物被培育成积累低水平的抗营养生物碱,忽视了它们作为有价值代谢物来源的潜力。窄叶羽扇豆(NLL)积累大量的工业利用价值的生物碱,称为(-)-sparteine。虽然(-)-sparteine被认为是手性合成中的关键辅助分子,但其可变的价格和有限的可用性阻碍了其大规模使用。有两种酶可以启动(-)-sparteine转化为NLL中积累的各种生物碱。第一个是属于71家族的细胞色素P450单加氧酶(CYP71D189),第二个是短链脱氢酶/还原酶(SDR1)。通过筛选一个非转基因NLL突变文库,并在CYP71D189中分离出一个敲除。基因敲除显示出代谢谱的改变,其中(-)-sparteine占种子中生物碱含量的96% (GC-MS基础)。从突变体种子中分离的(-)-sparteine是对映体纯的(99%对映体过量)。除了改变的生物碱谱外,突变体没有任何明显的表型。表明(-)-sparteine是NLL中大多数QAs的前体,并扩大了NLL作为作物的当前用途。

 

近日,国际著名杂志Plant Biotechnology Journal上发表了一篇为“Metabolic engineering of narrow-leafed lupin for the

production of enantiomerically pure (-)-sparteine”的研究文章,野生羽豆积聚大量喹诺齐啶生物碱(QAs),通过使用最先进的植物育种技术来设计NLL中QAs的天然生物合成途径,以生产具有商业价值的(-)-sparteine,这是不对称化学合成领域的关键分子。具体来说,sparteine和锂之间的配合物已被证明在常见的不对称过程中是极其重要。最初,只有(-)-sparteine在商业上可用,在每种情况下只能实现两种可能产物中的一种的不对称合成。这导致了一种具(+)-sparteine预期功能的可合成分子的发展,这种分子后来被称为(+)-sparteine。


羽扇豆素通常会积累复杂的QAs混合物,包括双环、三环和四环。从结构上看,sparteine是最简单的四环QA。羽扇豆素衍生的QA的对映体纯度与物种有关。而同样的QA在窄叶羽扇豆中似乎只以右旋形式出现。(图1)。

 

(图1)

由于参与特定代谢物通路的基因倾向于共表达,通过使用了可用的转录组学数据集选择了三种表达模式与已知QA途径赖氨酸脱羧酶(LDC)相似的氧化酶候选物,并通过农业渗透在烟叶中单独表达。与阴性对照(GFP)相似,表达CYP76E36和CYP71A168的叶片似乎不能代谢单独浸润的(-)-sparteine。相比之下,表达CYP71D189的叶片在(-)-sparteine浸润后产生了假定的双氢-parteinium离子(图2)。

(图2)

SDR1和CYP71D189在benthamiana叶片中的共表达导致(-)-sparteine浸入后二氢-drosparteinium离子水平降低,并出现(+)-lupanine,认为SDR1作用于CYP71D189的直接产物2-羟基sparteine。(图3)

(图3)

CYP71D189和SDR1在以(-)-sparteine为代表的主要QA途径以及以(-)-α-isosparteine为代表的次要QA途径中起作用。此外,认为(-)-multiflorine是由(-)-sparteine或相应的二价阳离子前体生成的(-)-sparteine。研究结果证实了(-)-sparteine的中间作用(图4)。

(图4)

通过对纯化的(-)-sparteine进行了手性GC-MS分析,结果显示其对映体过量高于商业标准,最后,我们从较大的M6分离出(-)-sparteine,包括结晶,作为亚硫酸盐。在这种情况下,平均产率为0.3%,非手性气相色谱-质谱分析纯度为98%,手性气相色谱-质谱分析纯度为99%。(图5)。

 

(图5)

本研究的的CYP71D189KONLL突出之处在于我们的目标代谢物(-)-sparteine先前不存在于原始植物中。还证明了FIND-IT技术的潜力作为CRISPR-Cas9的替代品,用于植物代谢工程,其中转化是前所未有的或技术上具有挑战性的。



原文链接:

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.14509

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