PBJ | 密歇根州立大学研究人员基于结构的重组提高光呼吸关键酶GLYK的热稳定性,进而提升植物的耐热性

学术   2024-11-23 10:40   湖北  

全球气温的迅速上升极大地影响植物生产力,高温会影响植物生长和发育的许多方面,从而降低作物产量。提高植物耐热性的一种方法是利用生物工程来增加催化生物过程的酶的热稳定性。光呼吸是植物中不可缺少的生理过程,因此光呼吸酶是增强植物耐热性的目标。
D-glycerate 3-kinase(EC 2.7.1.31; GLYK) 是一种单体叶绿酶,可催化光呼吸的最后一步。拟南芥基因组中存在一个 GLYK 基因 (AT1G80380)。尽管敲除该基因突变体植物可以在升高的CO2下生长但是降低该酶的活性或因热而失活可能会限制植物的生产力,这使得GLYK成为一个有吸引力的目标,以提高植物的耐热性。
目前已有几种方法用于提高酶的热稳定性。之前,rubisco酶的热稳定性是通过基因片段的随机重组和靶向突变来增强的。虽然在这种情况下是成功的,但随机重组可以产生大量可能的耐热酶进行分析,潜在地限制了这种方法的使用。另一种是在保持酶活性的同时提高蛋白质热稳定性的,也称为“基于结构的重组”。环(Loops)是蛋白质结构的重要组成部分,影响蛋白质功能的许多方面,包括底物识别和特异性、信号转导、蛋白质-蛋白质相互作用和热稳定性。然而loop区域及其在高温下的构象动力学很难单独使用序列来预测。利用蛋白质结构预测工具,如AlphaFold,可以将蛋白质序列扩展成三维蛋白质结构并确定环区域。AlphaFold提供的酶的静态快照可以通过经典的分子动力学模拟蛋白质在高温下的构象变化。
近日,国际著名期刊Plant Biotechnology Journal 发表名为“Increasing thermostability of the key photorespiratory enzyme glycerate 3-kinase by structure-based recombination”的文章,研究人员探究了温度对不同生物GLYK活性的影响,并使用AlphaFold预测的结构进行了分子动力学模拟;基于模拟,研究人员获得具有更强的热稳定性的杂交酶。该研究表明分子动力学模拟引导的基于结构的重组为提高其他植物酶的热稳定性提供了一种有前途的策略,并可能应用于提高植物在变暖气候下的耐热性。
研究人员比较了嗜温植物拟南芥、烟草、白菜(A. thaliana, N. tabacum and B. rapa)和嗜热藻类(C. merolae)的GLYK蛋白的热稳定性,分析结果表明,CmGLYK比植物GLYK蛋白具有更高的热稳定性。

图1 光呼吸途径

图2 拟南芥、烟草、白菜、嗜热藻类中的GLYK的热稳定性

为了评估各种GLYK蛋白之间的序列相似性,并确定可能涉及其不同热稳定性的分子特征,研究人员使用Jalview进行氨基酸序列比对。序列比对结果表明, 植物中的GLYK蛋白序列一致性和相似性较高,而CmGLYK与植物酶的一致性和相似性较低。对GLYK酶的氨基酸组成比较发现,与植物的GLYK酶相比,CmGLYK中精氨酸的比例更高,异亮氨酸的比例更低,这与在嗜热细菌、古细菌和真菌中观察到的酶的氨基酸组成趋势一致。

图3 CmGLYK氨基酸组成(%)

为了比较预测的结构并实现GLYK蛋白的分子动力学模拟,研究人员使用AlphaFold生成原子细节结构模型。分子动力学模拟鉴定了相对于CmGLYK RMSF升高的嗜常温GLYK的三个环区。在嗜温植物的GLYK酶中,随着温度的升高,这些环区移动更加自由。因此,AtGLYK中在高温下RMSF值升高且与ATP结合的Walker A基序空间相对较近的三个区域被选择替换为CmGLYK序列。这些区域分别由3-35个氨基酸组成,与AtGLYK的相应序列具有不同程度的同源性, 然后使用分子动力学对这些不同的杂交酶进行比较,以确定哪些环替换导致运动减少。替换部分的Loop 1 (H1AtGLYK)产生一种酶,其RMSF值比更接近AtGLYK,尽管总体上运动较少;当替换更广泛的Loop 1部分(H2AtGLYK)时,Loop 1区域更加刚性,RMSF与CmGLYK相似;进一步替换得到H3AtGLYK和H4AtGLYK。

图4 基于结构重组的Loops靶向和对Loop灵活性的影响

为了评估GLYK杂交酶的热稳定性,每个杂交酶在大肠杆菌中异位表达,纯化和表征。所有纯化的杂交酶均表现出glycerate 3-kinase 活性,研究人员表征了CmGLYK、AtGLYK和四种AtGLYK杂交酶的熔化温度,CmGLYK的熔化温度为59℃,而AtGLYK的熔化温度为53℃。H3AtGLYK和H4AtGLYK的热稳定性更强,其Tm比野生型AtGLYK高6℃,与CmGLYK相近。接着,研究人员评估野生型和杂交型GLYK酶在不同温度(25 ~ 65℃)下活性的温度响应, AtGLYK在60°C和65°C时检测不到活性,H4AtGLYK在这些温度下保留了60%和40%的最大活性,这与野生型CmGLYK相当。

图5 基于结构重组的杂交酶热稳定性的表征

为了进一步表征来自不同植物物种和重组杂交种的GLYK酶,研究人员在30°C下测量了Vmax、Km和Kcat。与AtGLYK相比,H2AtGLYK、H3AtGLYK和H4AtGLYK的比活度大约低2倍,但仍比CmGLYK高2倍以上,所有杂交酶的glycerate  Km都增加了,但ATP Km不受影响。H3AtGLYK和H4AtGLYK对glycerate和ATP的Kcat相对于AtGLYK略有降低。

图6 AtGLYK、NtGLYK、BrGLYK-1、CmGLYK和AtGLYK杂交酶的动力学参数

原文链接:https://doi.org/10.1111/pbi.14508
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