环境微生物的“平板计数异常”的谜题已然持续了一个多世纪。它指的是在典型环境样品中，通过显微镜计数测定到的细胞总数通常远远高于琼脂平板上菌落形成单位（CFUs，即可培养细胞数）的计数结果。“仅1%微生物可培养”（即绝大多数微生物不能被培养）这一描述已成为范式被人们广泛接受。但是，以往对细菌可培养率的估计几乎都是描述可培养细胞的比例，从微生物资源和多样性的角度看，可培养类群占所有类群的比例才更应被关注。由于培养条件与微生物在自然条件下生长条件高度不重合，目前大部分微生物仍然是“不可培养”或“未培养”的，包括在高分类阶元（如门、纲水平）没有可培养代表菌株的“微生物暗物质”。
2024年10月20日，郭峰副教授课题组在《Nature Communications》期刊上发表了题为“Sequencing-guided re-estimation and promotion of cultivability for environmental bacteria”的研究论文。该研究重新估算了环境细菌的可培养率，将其与经典的细胞水平可培养率进行比较，表明了过去可培养率的总体低估。同时，该研究提出将可培养属性作为表型，基于测序数据挖掘可培养细菌类群信息和基因组代谢潜力信息，用于指导分离培养特定微生物。
研究针对两类典型环境样本（6个土壤和5个活性污泥样本）中的细菌，采用了简化培养组学方法（不同氧气条件和培养基类型）。基于传统的显微计数和CFU计数测定细胞水平可培养率；通过测序掌握原始样品和平板培养后的细菌类群信息，从而计算分类单元可培养率（图1a）。结果显示，在样品全培养条件，分类单元可培养率远高于细胞水平可培养率（约为2.8-6.0倍）（图1c），这暗示以往测定的细胞水平的可培养率低估了环境细菌的可培养多样性。
研究还将在特定培养条件下的“可培养/不可培养”属性视为细菌的表型。这一表型信息可以从两个方面指导提升特定微生物的分离培养效率：1）基于可培养细菌的分类学信息，可以指示什么样品和什么培养条件可以培养出特定感兴趣的细菌类群，从而定点挖掘该菌；2）基于在限定范围内（研究中限定为一个细菌目），比较样品内的不可培养细菌和可培养细菌基因组信息，挖掘关键差异基因，可以反向推断在培养条件中需要改进的潜在条件。在本研究中，根据第1条，研究者从一个反应器污泥样本中在特殊培养条件下（原位培养基和厌氧条件），分离获取了一个新纲代表菌株EBPR01（图4）；根据第2条，我们发现Burkholderiales目的不可培养类群普遍缺失维生素B12合成基因，在培养基内补充维生素B12可以显著提高该目的可培养多样性（图6b，c）。
综上，本研究提出了基于测序的环境细菌可培养率评估和提升的新策略和方法。将测序技术与培养手段巧妙结合，有可能帮助我们找到更多让微生物暗物质“弃暗投明”的关键开关，缩小自然界微生物多样性与实验室中培养的微生物多样性之间的差距。培养更广泛微生物的能力的提高，为生物修复、生物技术和医学等领域的新发现打开大门。
厦门大学生命科学学院郭峰副教授为通讯作者，博士生郑敏佳、硕士生温林冉、何彩玲为该论文共同第一作者，其团队研究生也为该研究作出重要贡献。该研究得到了国家自然科学基金委、福建省自然科学基金等项目的资助。
图文/郭峰副教授课题组
编辑/林妍
校对/何燕青
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