一种猪病防控常用药材——降香的薄层指纹鉴别方法
文摘
三农
2024-09-25 17:00
北京
近年来，随着屠呦呦获得诺贝尔奖事件和中医药在抗击新冠疫情中发挥的巨大作用，中医药迎来了前所未有的发展机遇。而中兽医药与中医药一脉相承，传承国药精粹，是中医药领域的一颗明星，在生猪养殖过程中发挥着重要作用，尤其在抗病毒、提高免疫力等方面凸显出了独特魅力。但是，随着中医药、中兽医药产业的发展，中药材质量参差不齐，掺杂掺假现象屡见不鲜，有效成分相差悬殊，继而影响了猪病防控效果。当前最权威的中兽药质量标准以《中国兽药典》为准，现行的2020年版二部收载药材和饮片、植物油脂和提取物、成方制剂和单味制剂等，共计1 370种[1]。其质量标准收载的内容有性状、显微鉴别、薄层鉴别、浸出物、指纹图谱和含量测定等。其中，薄层鉴别的收载率相对较高，占收载药材的40%左右，但存在检测繁杂、效率低下、指标单一等问题，很难对药材的内在质量做出精准的综合质量评价，无法真正起到控制中药材品质的效果。降香是历版《中国兽药典》收载的中药品种，为豆科植物降香檀（Dalbergia odorifera T.Chen）树干和根的干燥心材，具有化瘀止血，理气止痛之功效，用于吐血、衄血，外伤出血，肝郁肋痛，胸痹刺痛，跌扑伤痛，呕吐腹痛。相关研究表明，其具有舒张血管、增加管状动脉流量、调血脂、降血压、抗凝血、抗血栓、抗心肌缺血、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、镇痛及抑制破骨细胞功能下降等药理活性[1]。降香的化学成分复杂，含有丰富的挥发油[2]和黄酮类[3]等成分，其中挥发油类包括橙花叔醇、氧化石竹烯、蒎烯、金合欢醇、桉树脑、红樟油、β-欧白芷内酯、香叶丙酮、α-白檀油醇、β-甜没药烯、反式苦橙油醇等[4]。黄酮类化合物包括黄酮类、二氢黄酮类、异黄酮类、二氢异黄酮类、异黄烷类、黄烷类、查尔酮类、新黄酮类、生物类黄酮、紫檀烷类等[1]。但降香檀生长周期长，且前5年生长较为缓慢[5]，导致药材掺杂掺假现象严重，影响临床用药疗效，仅通过性状、显微、理化等方法进行鉴别未能完全辨别降香的品种或真伪。近年来，一些学者采用液相色谱、气相色谱、气相色谱-质谱连用、液相色谱-质谱连用等建立各类成分的指纹图谱，但因对仪器性能要求高、对专业人员要求严、价格昂贵，导致检测成本高，难以普及推广，所以开发一种简便快捷、低成本、高效率、多信息、多指标评价降香药材质量的方法就显得尤为重要。在此背景下，金大康研发团队通过专题研究，建立了快速简便的降香药材薄层指纹鉴别方法。降香试验药材由浙江金大康保健品有限公司提供；降香对照药材（批号：120952-201709）购自中国食品药品检验鉴定院；硅胶G薄层板购自青岛海洋化工有限公司。仪器为KQ-300D超声波震荡仪，ZF-1型三用紫外光灯。甲醇、环己烷、乙酸乙酯均购自国药集团化学试剂有限公司；硫酸购自浙江汉诺化工科技有限公司；香草醛购自上海展云化工有限公司，以上试剂均为分析纯。取降香药材0.2 g，加甲醇2 mL，超声处理20 min，上清液作为供试样品溶液；另取降香对照药材0.2 g，同法制备对照药材溶液；吸取对照药材溶液和供试样品溶液各6～8 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比2∶1.5环己烷-乙酸乙酯为展开剂进行展开后取出并晾干。先将上述处理的硅胶G薄层板置紫外光灯365 nm下检视（检视条件1）；再喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色，再置紫外光灯365 nm下检视（检视条件2）；再喷以体积比为16的5%香草醛硫酸溶液-乙醇的混合溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，在日光下进行检视（检视条件3）。上述试验步骤重复3次。检视条件1下，在与对照药材色谱相应的位置上，供试验品显示相同颜色荧光斑点，共检视到10个不同强度的亮蓝或蓝紫色荧光斑点（图1-A）。检视条件2下，在与对照药材色谱相应的位置上，供试验品也显示相同颜色的荧光斑点，共检视到8个非常鲜亮的蓝色或蓝紫色荧光斑点（图1-B）。检视条件3下，在与对照药材色谱相应的位置上，依旧显示相同颜色斑点，共检视到粉、橙、黄、紫、黑等不同颜色的10种斑点（图1-C）。A.在视检条件1下的薄层TLC图B.在视检条件2下的薄层TLC图C.在视检条件3下的薄层TLC图
本方法以体积比2∶1.5环己烷-乙酸乙酯为展开剂展开后，置紫外光灯365 nm下检视到10个不同强度的荧光斑点，除Rf值约0.7处有1个蓝紫色荧光斑点外，其余9个都为亮蓝色荧光斑点（图1-A）；喷以10%硫酸乙醇溶液显色后，再置紫外光灯365 nm下检视，呈现出8个非常鲜亮的荧光斑点，5个为蓝色，3个为蓝紫色（图1-B）；对比图1-A和图1-B中的各荧光斑点的形状、大小、含有量、颜色和Rf值，结果显示均不一致，属于不同的化学成分。最后再喷以5%香草醛硫酸乙醇混合溶液显色后，日光下检视到粉、橙、黄、紫、黑等不同颜色的10种斑点（图1-C），从其形状、大小、含有量和Rf值，又与图1-A和图1-B的荧光斑点不重合，说明是其它与香草醛呈色的化学成分。同一块薄层板在3种不同检视条件下，检视到降香的28种信息斑点，归属约26种不同的化学成分，各成分虽相互重叠，但在各自的显色和检视条件下却互不干扰，均能呈现出清晰的荧光斑点或颜色斑点。每一味中药都是有机复合体，其化学成分极其复杂，有水溶性成分、中极性成分、脂溶性成分等，包括生物碱、甙类、蒽醌类、黄酮类、挥发油、树脂类、有机酸、色素、氨基酸、维生素、矿物质等，正因如此，中药发挥着多成分、多靶点、多途径、全方位的作用。而薄层色谱依据中药各有效成分的化学结构与性质，遵循相似相溶的提取原则，采用适宜的提取溶剂，简便快捷地制备供试品溶液与对照药材溶液。再通过适宜的展开剂进行展开，借助各成分在薄层板上的吸附、解吸附能力的不同，使其信息斑点得以分离。再借助各成分化学结构不同，与不同显色试剂显色后，可以产生不同荧光或各种颜色的原理，获得多指标、多信息的检测效果。目前，《中国兽药典》2020年版二部降香项下收载了2种薄层鉴别方法，其中一种以甲苯-乙醚-三氯甲烷（7∶2∶1）为展开剂展开后，检视与香草醛显色的颜色斑点；另一种以甲苯-乙酸乙酯（2∶1）为展开剂展开后，检视紫外光365 nm下的荧光斑点。查找相关文献，薄层鉴别方法大多采用药典方法，仅有少数以提取的挥发油作为供试品溶液，进行脂溶性成分检测，但不管是何种检测方法，均只是单一检视条件下的部分信息。而本方法采用甲醇超声的上清液作为供试品与对照药材溶液，同一块薄层板依次在3种不同检视条件下检视，可检视到降香的28种信息斑点，归属约26种不同的化学成分。与《中国兽药典》2020年版二部降香项下收载的2项薄层鉴别相比，本试验不只1板完成了兽药典2板的检测指标，还额外检测了增荧光的化学成分斑点，获得事半功倍的效果。省时、省力、成本低、效率高、检测信息量大，大幅度提高了降香药材的质量可控性，有利于市场质量监督。本方法只需药材和对照药材各0.2 g，提取溶剂4 mL，薄层板1块，展开剂15 mL，用时1 h，即可得到26种不同成分的信息斑点。本方法的展开剂中既不含毒性大的苯、甲苯等有机溶剂，又不含沸点低、极易挥发的乙醚，只有毒性较低、沸点一般的环己烷和乙酸乙酯，有利于环境保护和职业健康。置紫外光灯365 nm下检视，共检视出10个不同强度的亮蓝或蓝紫色荧光斑点。以10%硫酸乙醇溶液显示后，105 ℃加热至斑点显色，再置紫外光灯365 nm下检视，共检视出8个非常鲜亮的蓝色或蓝紫色荧光斑点。再以体积比为1∶6的5%香草醛硫酸溶液-乙醇的混合溶液2次显色，在105 ℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，共检视出粉、橙、黄、紫、黑等不同颜色的10个斑点。该方法简便快捷、低成本、高效率、多指标、多信息地对降香药材做出整体、综合的质量评价，真正控制降香药材的内在质量，确保相应制剂在防控猪病中疗效确切。作者：赵丽丽1，兰新财1，缪雨臻1，沈超雄1，周晓义1，李思鸿2，章红兵3，安丽娜1*单位：（1.浙江金大康动物保健品有限公司，浙江 金华 301016；2.金华职业技术学院，浙江 金华 321007；3.浙江农林大学，浙江 杭州 311300）[1] 何欣,杨云,赵祥升,王灿红,魏建和,孟慧.降香化学成分及药理作用研究进展[J].中国现代中药,2022,24(6): 1149-1166.[2] 林励.不同品种降香质量研究[J].中药材,1997,20(7):366.[3] 蓝贤军.降香理化鉴别方法的改进[J].中药材,1995, 18(4):187.[4] 刘洪玲.GC-MS法分析降香挥发油化学成分[J].中成药,2009,31(6):915-917.[5] 邱治军,周光益,陈升华.海南特有珍贵红木树种:降香黄檀[J].林业实用技术,2004(6):41-42.声明：本公众号未标明原创的部分内容来自互联网，版权归原作者所有，仅供交流学习之用，不用于商业行为。如有侵犯了企业、媒体、公司、个人的知识产权，请联系删除。联系电话：010-51503592。
