2类V型CRISPR-Cas12效应物表现出巨大的多样性，利用单crRNAs或双RNA向导靶向双链DNA（dsDNA）、单链DNA （ssDNA）或RNA。对于dsDNA靶标，Cas12识别不同的PAM序列，并在靶dsDNA上产生粘端。与SpCas9相比，这一特性提高了同源性定向修复的效率，并且导致的脱靶效应更小。2024年11月8日，南方科技大学朱健康、贾宁共同通讯在Cell Research（IF=28）杂志在线发表了题为“Structure and genome editing activity of the novel CRISPR-Cas12o1 effector”的研究论文，该研究报道了新型CRISPR-Cas12o1效应子的结构和基因组编辑活性。最近的研究已经鉴定出一系列Cas12核酸酶，从Cas12a到Cas12n，从而大大扩展了基因编辑工具。然而，在已报道的Cas12蛋白中，紧凑型蛋白通常表现出有限的基因编辑效率，并与长链非编码RNA向导或双RNA （crRNA和tracrRNA）向导结合，这可能弥补了某些Cas12结构域的缺失，提高了内切酶活性和编辑效率。为了在哺乳动物和植物细胞中高效地扩大基于Cas12的基因编辑工具的范围，研究人员确定了几个新的Cas12候选基因（800-1300个氨基酸（aa））。值得注意的是，这些蛋白表现出与Cas12b最密切的系统发育关系，尽管它们更紧凑，缺乏tracrRNA。因此，研究人员将这个新家族命名为V-O型CRISPR-Cas120蛋白家族。其中，Cas1201包含908个残基，并与单个CRISPR阵列结合，该阵列具有36个碱基对（bp）重复序列，由34-38-bp间隔序列分隔。值得注意的是，cas1201可以切割目标链（TS）和非目标链（NTS），其中NTS的切割率更高。此外，cas1201在被互补的ssDNA/dsDNA顺式激活时表现出非特异性的ssDNA/ssRNA切割，突出了其作为核酸检测诊断工具的潜力。![]()
cas1201识别PAM的结构细节（图源自Cell Research）Cas1201蛋白采用传统的双叶结构，包括一个由螺旋- i和螺旋- ii结构域组成的识别（Rec）叶，以及一个含有寡核苷酸结合结构域（OBD）、RuvC结构域和C-末端Nuc结构域的核酸酶（Nuc）叶。Cas1201的crRNA重复区域的拓扑结构是将cas1201与其他Cas12核酸酶区分开来的主要区别特征。它主要由OBD和螺旋ii结构域识别。具体来说，除了G-34和G-36核碱基被残基D673、S387和R388识别外，crRNA的茎1通过涉及OBD和Helical-II结构域的序列无关的氢键相互作用稳定。总之，该研究发现了一个新的CRISPR- V型核酸酶家族，即V-O型cas120核酸酶。cas1201具有紧凑的大小（908 aa）和短的单crRNA (56 nt)，并表现出对起始密码子“ATG”PAM序列的偏好。利用冷冻电镜技术，研究人员确定了cas1201及其Cas12o1E100K变体与crRNA和靶dsDNA复合物的结构，揭示了PAM依赖性dsDNA切割的机制，并强调了E100K突变如何提高基因编辑效率。利用结构导向的理性工程技术，还开发了一个Cas12o1变体，该变体具有与SpCas9相当的基因编辑效率，并且可以识别广泛的PAM序列，因此cas1201具有作为一种适用于动物和植物的多功能基因组编辑工具的巨大潜力。
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