Adv. Sci.丨宫内生长受限新生儿对肝损伤的性二型反应（解读）

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摘要

胎儿宫内生长受限（IUGR）是指胎儿的生长不符合预期，与肝功能减退和成年后患慢性肝病的风险较高有关。利用早期发育的可塑性来扭转胎儿发育不良的结果仍是一个尚未探索的领域。根据新生儿的生化特征和之前的转录组研究结果，我们选择来自同一胎儿的仔猪作为研究 IUGR 的模型。通过 scRNA-seq 建立肝脏的细胞图谱，揭示IUGR诱导肝损伤的性别依赖模式。IUGR 仔猪出生一周后会经历缺氧应激。IUGR 女性表现出成纤维细胞驱动的T细胞转化为免疫适应表型，从而有效缓解炎症并促进肝脏再生。相比之下，男性的肝损伤更为严重。脂质代谢紊乱导致的长期炎症阻碍了非免疫细胞之间的细胞间交流，最终影响肝脏再生，甚至影响成年后的肝脏再生。此外，载脂蛋白A4 (APOA4) 可减少肝脏甘油三酯沉积，作为IUGR 男性对缺氧的一种保护性反应，从而作为一种新型生物标志物进行研究。PPARα激活可减轻 IUGR 男性的肝损伤，同时将过度表达的 APOA4 恢复正常。这项开创性的研究为了解 IUGR 期间肝损伤的性别双态反应提供了宝贵的见解。

生化指标和相关肝脏 RNA-seq数据重分析证实了IUGR导致的男性肝损伤

新生儿的生化指标存在性别差异。与男性相比，女性的总蛋白（TP）和白蛋白（ALB）水平明显较高，但天冬氨酸氨基转移酶/丙氨酸氨基转移酶（AST/ALT）比率较低。根据出生体重（<2500 克和≥2500 克）进行进一步分类后发现低体重儿组的 TP和ALB 水平均低于正常组。然而，与正常组相比，男性低体重组的碱性磷酸酶（ALP）和谷草转氨酶/谷丙转氨酶（AST/ALT）升高，而球蛋白（GLOB）和胆碱酯酶（CHE）降低。这些观察结果在女性中未出现。通过配对分析，正常体重仔猪和 IUGR 仔猪的血清参数显示了在人类低体重儿和正常婴儿身上观察到的类似趋势。与正常仔猪相比，IUGR 仔猪的生长能力大大降低，其特点是出生体重、一周后体重和总体增重都较低。所有 IUGR 仔猪的 IGF-1 水平都明显下降。IUGR 个体的高密度脂蛋白胆固醇明显升高，而男性和女性 IUGR 个体的总胆固醇水平变化不同。在器官方面，与相应的正常体重仔猪相比，患有 IUGR 的男性和女性个体的肝脏指数都有不同程度的升高。

对PRJNA597972的RNA-seq数据进行的重新分析。出生一周后，患 IUGR 的男性比女性有更大的转录紊乱。IUGR男性共有1074个差异表达基因（DEG），而IUGR女性仅有192个差异表达基因。其中有 13 个上调基因和 5 个下调基因交叉表达。IUGR 个体出生一周后 EPO 和 GAPDH 的表达增加。功能富集分析表明，HIF-1 信号通路在两种性别中均有显著上调，而 TNF 信号通路则显示出相反的趋势。IUGR相关的肝损伤和炎症存在性别差异，强调了宫内缺氧是 IUGR 的主要病因，并指出了男性和女性不同的功能机制。为了进一步探讨 IUGR 男性猪成年后转录受损的影响，我们重新分析了 GSE106512的数据，并重点研究了 150 日龄时 NBW 和 IUGR 猪的差异。在 IUGR 男性的肝脏中发现了持续的异常代谢，尤其是脂质代谢。某些信号转导过程，包括增殖、分化和免疫调节，在婴儿期受到干扰，而细胞周期和 Hippo 信号通路的破坏在成年期变得明显。对牧场产仔数据的分析表明，男性 IUGR 的发生率略高。在此基础上，我们进行了 scRNA-seq 和脂质组学研究，以了解 IUGR 肝损伤过程中性双态性的复杂分子机制。

仔猪与人类肝脏综合单细胞转录谱的高度同源性

我们收集了正常仔猪和IUGR仔猪的8个肝脏组织样本进行scRNA-seq分析，每组分别取自男性（n = 3）和女性（n = 1）。去除环境 mRNA 并根据检测到的基因数量和线粒体读数计数进行严格的质量筛选后，保留了 41,969 个细胞的高质量数据集。聚类分析确定了 22 个代表不同细胞群的主要聚类，包括淋巴细胞、骨髓细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、红细胞群和粒细胞。簇特异性标记和经典标记用于准确注释细胞类型。为了确定猪和人在细胞结构和分子特征方面的一致或差异程度，我们整合了分别来自 GSE13610 和 E-MTAB-7407 的健康成人肝脏和胎儿肝脏的单细胞数据，发现人和猪的细胞亚群之间存在大量重叠。通过使用猪细胞转录组进行模块化聚类，我们发现猪肝脏中调控细胞分化的转录因子与人类一致。例如，HNF1A 和 THRB 可促进更成熟肝细胞的生成；PAX5 可控制 B 细胞；GATA1 和 TAL1 可调节红细胞的成熟；SOX7 与内皮转化密切相关；RUNX3 和 TBX21 在 T 细胞的生长和极化过程中起着关键作用。尽管来自不同时间点的人类肝脏数据中主要细胞类型的比例不同，但每种细胞类型的细胞周期阶段分布在两个物种之间非常相似（图 2f）。这些发现共同表明，猪肝脏是探索人类肝脏疾病的有意义的模型。

IUGR 男女性细胞水平的转录谱变化不同

从细胞比例来看，IUGR女性和男性的红细胞都显著增加。在女性中，NK/NKT 细胞、T 细胞、单核细胞和 Kupffer 细胞的比例发生了一定程度的变化。在男性 IUGR 仔猪中，无论是否考虑红细胞，Kupffer 细胞和 NK/NKT 细胞的数量都有所增加。由于仅根据细胞比例得出结论可能会产生误导，我们研究了主要细胞类型中的 DEGs，同时富集功能比较。在 IUGR 女性中，与 NK/NKT 细胞、单核细胞和 T 细胞相关的 DEGs 多于其他细胞类型。这些 DEGs 与细胞因子刺激反应、细胞活化、细胞防御调控、应激、细胞粘附和炎症反应相关的功能改变有关。IUGR 女性的非免疫细胞变化极小，这可能表明免疫系统在特定时间点适应了 IUGR 的影响。相比之下，在 IUGR 男性中，与 Kupffer 细胞、内皮细胞和肝细胞相关的 DEGs 多于其他细胞类型。Kupffer细胞中的DEGs富集在巨噬细胞活化途径中。细胞对脂质反应的功能性变化表明，脂质与巨噬细胞的活化之间存在潜在的关系。此外，IUGR 男性内皮细胞的血管发育和血管生成受损，肝细胞的酮代谢发生改变，解毒功能下降。总体而言，女性淋巴细胞受 IUGR 的影响最为显著，而男性骨髓细胞和肝脏非免疫细胞受 IUGR 的影响最为显著。

女性的免疫适应反应，可减轻 IUGR 引起的肝损伤

CellChat分析揭示了IUGR女性淋巴细胞、成纤维细胞和内皮细胞之间相对强大的相互作用。在 IUGR 期间，PTN-NCL 和 CXCL2-CXCR4 等关键配体-受体相互作用的活性增加，这表明成纤维细胞的活化可能会影响淋巴细胞亚群的分化。与 NBW 女性相比，IUGR 女性体内 HGF、VEGF、FGF、PTN 和 EGF 等各种生长因子的信息流更高。我们证实 IUGR 雌性动物的肝脏 HGF 蛋白表达水平和血清 E2 含量均高于 NBW 雌性动物。进一步评估女性淋巴细胞的异质性确定了四个主要的 T 细胞亚群、五个 NK 细胞亚群和一个 NKT 群。根据 CD4 或 CD8 的表达确定了三个 CD4+ T 细胞亚群，揭示了发育分化的轨迹。所选的 T 细胞功能相关基因在 CD4+ T 细胞亚群中进行了比较，如高表达 CCR7 和 IL7R 的细胞为幼稚 T 细胞，高表达 FOXP3 和 CTLA4 的细胞为 Treg T 细胞，其他细胞为 Th-like 细胞。CD4+ T细胞的Monocle轨迹分析显示了一条从幼稚T细胞开始，逐渐转变为Treg T细胞，并有Th样细胞分支的分化轨迹（图3f）。为了评估所构建轨迹的精确性，我们观察了两种命运的 T 细胞分化过程中基因在伪时间内的表达水平。CCR7、IL7R 和 LEF1 在 T 细胞静止期高度表达。HOPX和PDK1调控Th样细胞的分化（Fate1）,FOXP3和CTLA4调控Treg细胞的分化（Fate2）。分支热图显示了两种命运之间具有显著动态变化的基因（图S7d，佐证信息）。根据 GO 分析，类 Th 细胞（Fate1）与调节细胞的激活有关，而 Treg 细胞（Fate2）则与免疫系统过程的下调有关。特别值得注意的是，在 IUGR 女性中检测到了更高比例的 Treg 细胞（IUGR 组为 48.5%，而 NBW 组为 41.6%）。通过 ELISA 和 CD4+FOXP3+ 共染，验证了这一发现。IUGR女性中Treg T细胞的增加表明，肝组织可能向免疫耐受过渡，以减轻产后一周IUGR诱导的炎症造成的肝损伤。

男性招募更多的 Kupffer 细胞并通过 PRDM1 诱发炎症，从而加剧 IUGR 肝损伤

验证通过 scRNA-seq 观察到的 IUGR 男性 T 细胞数量的减少和 Kupffer 细胞数量的增加，采用流式细胞术检测了 CD45+CD3E+ 和 CD45+CD14+CD163+ 细胞的百分比。观察到的这两个参数的模式在统计学上与 scRNA-seq 数据相吻合。CellPhoneDB 分析用于探索男性肝组织的细胞-细胞通讯网络。在 IUGR 男性中，髓系细胞和非免疫细胞之间存在主导关系，细胞间信号减少。重要的配体-受体（L-R）对，如 PTPRC 和 MRC1，在 IUGR 男性中被激活。MRC1 的高表达表明 IUGR 诱导的肝损伤导致男性招募了更多的 Kupffer 细胞。普鲁士蓝染色和免疫组化证实，IUGR男性比NBW男性有更多的Kupffer细胞和更强的MRC1表达信号。通过推断状态轨迹探索了骨髓细胞的动态免疫状态和细胞转换，单核细胞位于轨迹路径的起点，而直流电细胞和 Kupffer 细胞占据两个末端状态之一。从单核细胞通过 JAK-STAT 信号通路和脂肪细胞因子激活开始，经过以 cDCs 为特征的中间增殖状态，接着是以 pDCs 和一些 Kupffer 细胞为特征的吞噬状态，最后是以 Kupffer 细胞为特征的代谢紊乱和炎症状态。在终末状态中，Kupffer 细胞占主导地位，其在 IUGR 男性中的比例远高于在 NBW 男性中的比例，这表明 Kupffer 细胞以某种方式被激活和招募。IUGR 男性在终末期通过 NFκB 发送 TNFα 信号的得分较高，单核细胞期后甘油脂代谢的 AddModule 评分较高，但在女性髓系细胞中未观察到这种效应。IUGR 男性处于炎症状态，其 TLR4 和 phospho-NFκB p65 蛋白表达水平高于 NBW 男性。研究结果表明，IUGR 雄性动物的 Kupffer 细胞受到了严重影响。

对细胞进行非负矩阵因式分解聚类，以探索 Kupffer 细胞内部的异质性。Kupffer 细胞被聚类为三种不同的亚型，并确定了每种亚型中功能富集的专属因子。炎症亚型富集于 TNF 信号通路，高表达 NFKBIZ、KLF6、TNF 和 DUSP1，类似于 M1 型巨噬细胞；非炎症亚型富集于氧化磷酸化，高表达 RACK1、ATP5PF、RPL36AL 和 TMSB10，类似于 M2 型巨噬细胞；而增殖则以 MKI67 和 TOP2A 为特征。促炎和抗炎基因集的得分被用来验证亚型分类的准确性。与 NBW 男性相比，IUGR 男性炎症亚型的比例更高（IUGR 组为 45.7%，NBW 组为 36.8%）。通过沿着伪时间轨迹绘制这些基因，并通过剪接和未剪接 mRNA 的比率（RNA 速度）分析其方向性，提示了从非炎症亚型到炎症亚型的潜在转变。NBW男性的炎症亚型在活性氧通路上表现出更高的得分，类似于典型的M1巨噬细胞产生ROS的能力。因此，为了探索这一过程是否存在不同的调控模式，我们采用了 pySCENIC 来从机制上了解亚型的转录调控。每种细胞类型的前 5 个特定转录因子被显示出来并映射到 UMAP 图上。通过比较NBW和IUGR个体对炎症亚型的转录调控，在IUGR男性中观察到PRDM1的调控子活性得分更高。PRDM1 与 SEEK 数据集对肝脏中巨噬细胞的研究有关。简而言之，IUGR诱导的男性肝损伤导致更多的Kupffer细胞被招募，PRDM1被激活，从而诱导炎症亚型，这可能与缺氧环境或脂质代谢改变有关。

炎症环境扰乱IUGR男性肝脏非免疫细胞亚群间的通讯网络

确定了 14 个非免疫细胞簇。这些聚类包括七种不同亚型的内皮细胞（Endo）、四种亚型的成纤维细胞以及两种亚型的肝细胞（Hep）和胆管细胞。每个亚型都有独特的特征基因。IUGR 男性和 NBW 患者的肝上皮细胞构成存在差异。内皮细胞与肝脏再生之间千丝万缕的联系一直备受关注，这促使我们根据富集的标记物对内皮亚型进行 GO 分析，以全面揭示其异质性和功能。肝脏血管内皮包括肝窦内皮细胞（LESCs）和血管内皮。Endo1、Endo2和Endo3与肝窦状内皮细胞的功能相似，而Endo4、Endo5和Endo6则与血管内皮有关。我们发现Endo1和Endo2是门静脉周围LSECs（OIT3、FCN2、HGF）；Endo3是中心静脉LSECs，富含免疫通路；Endo4是静脉ECs（CD34、PECAM1）；Endo5是毛细血管ECs（RGCC）；内皮源性基质细胞（APOLD1、CD9、MMP2），表现出细胞质翻译和细胞外基质组织。IUGR个体参与炎症亚型的信号转导强度显著上调，但与上皮细胞、内皮细胞和间充质细胞相关的信号转导强度下调。PTH、GDF、BRADYKININ 和 SCT 的信号在 IUGR 男性中完全消失。IUGR还导致大多数信息流的低活性，包括抗炎因子（IL-10、CSF）、调节生长和发育的因子（IGF、BMP、TGF-β）以及促进肝脏再生的因子（WNT、HGF、EGF）的产生。然而，IUGR 激活了促炎症信号（IL-6、TNF-α、MIF）。全局通讯模式识别分析表明，Hep1和胆管细胞分别在GDF和SCT信号转导中发挥作用，由于 IUGR，大多数细胞类型都受到了 IL-6 信号的影响。与正常体重男性相比，IUGR男性的TNF-α和IL-6水平明显升高。IUGR导致WNT和TGF-β的细胞通讯网络更加简单，并且缺乏相关配体-受体对的表达。免疫荧光（IF）或免疫印迹（WB）证实，在患有 IUGR 的雄性动物中，WNT2 和 HGF 的表达强度较弱。我们的数据显示，IUGR 引起的炎症明显扰乱了男性肝脏非免疫细胞的通讯网络。

肝功能异常导致的甘油三酯沉积以及代谢结果的改变是IUGR男性加剧炎症的必要因素

与 IUGR 女性相比，IUGR 男性肝脏中的 TG 累积更为明显。对肝细胞亚型的进一步分析表明，Hep2 的 mRNA 特征和数量明显少于 Hep1。因此，我们对 Hep1 功能富集分析发现细胞质翻译和 ATP 代谢过程，反映了肝细胞损伤。一系列肝脏病理切片证实，与 IUGR 女性相比，IUGR 男性表现出更明显的肝损伤和肝功能改变。H&E 和 PAS 显示，IUGR 男性动物有明显的炎性淋巴细胞浸润和明显的空泡，并伴有糖原累积。油红 O 染色和透射电子显微镜显示，IUGR 男性体内脂质堆积，细胞质物质流失，脂滴增加，线粒体和内质网退化。男性样本中共鉴定出 1095 种脂质。聚类分析和 OPLS-DA 都描述了NBW和IUGR雄性动物之间不同的脂质模式。按含量对脂质进行分类后发现，大多数脂质在IUGR雄性动物中的含量高于NBW雄性动物。火山图显示了 IUGR 男性和 NBW 男性之间 82 种不同的脂质（81 种上调），主要属于 TG 和肉碱（CAR）类。z-score图描述了IUGR导致的脂质紊乱情况。BMP（20:4_22:6）是一种对氧化还原反应敏感的脂肪分解促进剂，是 IUGR 男性中唯一下调的脂质。参与脂肪酸转运的 CARs 上调，表明 IUGR 雄性动物线粒体中脂肪酸的 β 氧化过程失调。最后，通过 ROC 曲线分析，CAR（C12-OH）、CAR（C16-OH）和 TG（16:0_16:0_18:1）与 IUGR 密切相关（图 6f）。

IUGR 男性肝组织和血清中的极低密度脂蛋白（VLDL）水平降低。由于 VLDL 在肝脏转运和清除 TG 的过程中起着关键作用，IUGR 男性体内 VLDL 的分泌减少可能是导致 TG 累积的关键因素。我们注意到，在 Hep1 和 RNA-seq 数据中，与脂蛋白家族相关的基因表达水平存在差异。令人惊讶的是，在不同的测序策略中，IUGR 男性中的 APOA4 持续、强劲地上调，而 IUGR 女性中却没有这种情况。IUGR 男性在门静脉三联体周围观察到 APOA4 阳性肝细胞增多。通过 ELISA 检测，IUGR 引起的血清和肝脏中 APOA4 含量均较高。IUGR 男性肝脏中 APOA4 mRNA 和蛋白表达水平升高。

为探讨缺氧诱导的肝损伤与炎症之间的密切关系，用 PMA 诱导 THP-1 细胞中的巨噬细胞，并对其进行四种干预：a）LPS 和 IFN-γ 处理作为 "阳性 "对照；b）1% 氧气条件；c）在缺氧条件（1% 氧气）下培养的 HepG2 细胞系的培养基；d）在正常条件（21% 氧气）下培养的 HepG2 细胞系的培养基（图 7a）。细胞呈现梭形形态，假足延长，表明向 M1 表型分化。作为阳性对照，M1 巨噬细胞中 IL-6、TNF-α、PRDM1 和 IL-10 的 mRNA 水平显著上调（图 7b）。在缺氧条件下干扰 HepG2 细胞系的培养基（c）会增加炎症因子（如 IL-6 和 TNF-α）和转录因子（如 PRDM1）的 mRNA 水平，而直接缺氧培养处理会导致 IL-10 的 mRNA 水平增加。暴露于基于缺氧培养基的 HepG2 细胞系巨噬细胞中的磷酸-NFκB p65 蛋白水平也升高。综上所述，我们的研究结果表明，低氧诱导的肝损伤引起的代谢紊乱会促进巨噬细胞向 M1 表型分化。

APOA4 通过介导 PPAR 信号通路调节甘油三酯沉积，缓解缺氧诱导的肝细胞损伤

APOA4 过表达仅限于肝细胞，其意义仍然难以捉摸。猪和人的 APOA4 氨基酸序列高度同源（80.11%）。我们采用 CRISPR-Cas9 技术对 APOA4 的三个外显子区进行特异性基因敲除，以更好地了解 APOA4 在缺氧诱导的损伤过程中对肝脏脂质代谢的调控作用。我们成功建立了 APOA4-KO HepG2 细胞系。随着缺氧时间的延长，细胞内 TG 含量稳步增加，而 APOA4 的缺失会加速 TG 的沉积。使用 RNA-seq 比较了两种细胞系在缺氧处理后 0、24 和 48 小时的 mRNA 表达谱。PCA 显示，缺氧后 APOA4-KO HepG2 细胞系与正常 HepG2 细胞系的基因表达模式存在显著差异。随着缺氧时间的延长，发现的 DEGs 数量增加，尤其是与代谢途径相关。GSEA 显示，APOA4 的缺失导致 PPAR 信号通路持续受影响。通过使用 WGCNA 和基因时间序列聚类分析，我们成功地确定了与TG水平或缺氧处理持续时间呈正相关或负相关的基因模块。使用 RT-qPCR 检测了从上述模块和 PPAR 信号通路相关基因列表中获得的重叠基因的 mRNA 表达水平。结果显示，APOA4 的缺失会影响脂质的分解（如 ACOX1、ACSL4、CPT1A、ACSL5、ACSL1、ACOX3、ACAA1、ACOX2、PPARα）、合成（如 ANGPTL4 和 PPARγ）和运输（如 APOA4、SCL27、SCL27）。这些研究结果共同表明，IUGR 男性 APOA4 表达的显著增加可能代表了一种潜在的缺氧保护机制。先前的研究也表明，APOA4 表达的增强可缓解肝脏脂质紊乱。

调节 PPAR 信号通路可修复 IUGR 引起的肝损伤，从而缓解男性 APOA4 的表达

淫羊藿苷(ICA)作为PPARα的激动剂，有效地调节PPAR信号通路，发挥降脂作用。男性IUGR仔猪从第7天到第28天每天口服ICA(20 mg/kg)，并在安乐死后采集肝脏和血清样本。接受 ICA 治疗的 IUGR 男性表现出更好的生长性能和血清IGF-1水平。同时，血清中的各种肝功能参数趋于正常化，接近NBW个体观察到的水平。另外，与IUGR男性相比，接受ICA治疗的IUGR男性的相对肝脏重量和肝脏甘油三酯含量显著降低；炎症反应减轻，炎症因子，如IL-6和肿瘤坏死因子-α水平下降；PPARα和HGF蛋白表达增加，而磷酸化核因子κB p65蛋白表达降低；门脉三联体周围APOA4表达显著下调，APOA4阳性肝细胞数量减少。通过一系列组织学染色的验证表明，ICA在减轻IUGR诱导的肝损伤方面有效，包括减少空泡化、减轻免疫渗透、恢复线粒体形态、减少脂滴和减少库普弗细胞的募集。上述结果表明APOA4在IUGR中的表达与PPAR信号通路之间存在复杂的联系，突显了APOA4作为IUGR所致肝损伤的治疗靶点和生物标志物的相当大的潜力。

结论

局限性。首先，女性单细胞测序样本的局限性是由于采样期间女性 IUGR 的发病率较低。其次，缺乏空间维度来验证旁分泌或细胞间接触。最后，IUGR男性患者在更严重的肝损伤下存活的复杂机制仍然难以捉摸。在未来的研究中，有必要探索代表机体保护性反应的 APOA4 的异常表达所涉及的正反馈调节机制，以及 IUGR 诱导的肝损伤过程中 PPAR 信号通路的调节机制。 

总之，通过scRNA-seq进一步解读了出生后一周IUGR肝脏与性别相关的反应。与IUGR女性可以适应性地调节炎症以修复肝损伤不同，早期干预对IUGR男性至关重要，以减轻成年后肝脏的脆弱性和敏感性。这些干预措施应侧重于加强脂质代谢，这是减轻导致更严重肝损伤的过度炎症的先决条件。我们的研究结果可为制定针对不同性别的策略提供有益的参考，以早期干预IUGR诱发的肝损伤。