HRS-4642 的抗肿瘤功效及其与蛋白酶体抑制剂联合治疗 KRAS G12D 突变癌症的潜力

学术 2024-07-12 19:52 日本

*仅供医学专业人士参考

发表杂志：Cancer Cell

发表时间：2024年6月27日

关键词：KRAS G12D、HRS-4642、卡非佐米、肿瘤免疫微环境

图示摘要

要点

HRS-4642，一种 KRAS G12D 抑制剂，展示了临床前抗肿瘤效果
HRS-4642 治疗在 KRAS G12D 突变患者中引发了客观缓解
蛋白酶体作为 HRS-4642 的增敏靶点，增强了其抗肿瘤功效
HRS-4642 单独使用或与卡非佐米联合使用有效地塑造了肿瘤微环境

简述

周等人报道了 KRAS G12D 特异性抑制剂 HRS-4642 的强大临床前和临床抗肿瘤功效及其与卡非佐米的增敏联合策略。这项工作为缺乏有效靶向治疗的 KRAS G12D 突变的实体瘤患者提供了新的治疗方案。

摘要

KRAS G12D 是实体瘤中最常见的致癌 KRAS 亚型，在临床上仍无法通过药物治疗。在此，我们开发了一种高亲和力、选择性、长效且非共价的 KRAS G12D 抑制剂 HRS-4642，其亲和力常数为 0.083 nM。HRS-4642 在体外和体内均显示出对 KRAS G12D 突变癌症的强大疗效。重要的是，在一期临床试验中，HRS-4642 在剂量递增组中显示出有希望的抗肿瘤活性。此外，通过全基因组 CRISPR-Cas9 筛选，我们揭示了 HRS-4642 的敏感性和耐药性谱，其中蛋白酶体被确定为敏感性靶点。我们进一步观察到，蛋白酶体抑制剂卡非佐米增强了 HRS-4642 的抗肿瘤疗效。此外，HRS-4642 无论是作为单一药物还是与卡非佐米联合使用，都能重塑肿瘤微环境，使其趋向于免疫许可状态。总之，本研究为目前缺乏有效治疗手段的 KRAS G12D 突变癌症患者提供了潜在的治疗方法。

引言

KRAS G12D 是胰腺导管腺癌（PDAC）和结直肠癌中最常见的 KRAS 突变亚型，在肺腺癌（LUAD）中是第二常见的。KRAS G12C 可通过针对突变半胱氨酸残基的共价抑制剂成功抑制，KRAS G12D 则不同，它在开关 II 结合袋附近缺少一个活性残基，这使得共价抑制剂的开发具有挑战性。目前，多个研究团队已经采用不同策略开发了 KRAS G12D 特异性抑制剂。例如，MRTX1133 是一种占据开关 II 口袋的非共价抑制剂，通过阻碍核苷酸交换和效应物结合，显示出抗肿瘤功效。其他抑制剂，包括 RMC-9805， TH-Z835，和 BI-2852，也已被识别。然而，这些方案均处于临床前和初步临床评估阶段。在临床环境中，KRAS G12D 仍然难以药物化。

此外，KRAS抑制剂面临的一个重要挑战是大多数患者对这类治疗没有反应，而且初始有应答者最终会不可避免地遭遇疾病进展。例如，sotorasib、adagrasib和divarasib单药治疗显示了从到的目标反应率和中位无进展生存期为4.0-13.1个月，这突显了迫切需要联合策略以提高KRAS抑制剂的疗效。在此背景下，Yaeger等人发现，通过西妥昔单抗阻断RTK可以提高KRAS G12C在结直肠癌中的靶向疗效。同样，Hallin等人发现，KRAS G12D抑制剂MRTX1133与西妥昔单抗联合使用显示出增强的抗肿瘤效果。这些发现强调了识别增敏靶点以提高KRAS G12D抑制剂疗效的重要性。

在本研究中，我们开发了一种专门针对KRAS G12D的抑制剂，命名为HRS-4642。据我们所知，HRS-4642是首批进入临床试验的同类药物之一（NCT05533463）。我们在KRAS G12D突变癌症的临床前模型和患者中观察到了HRS-4642的抑制效果和高选择性。此外，通过全基因组CRISPR-Cas9基因敲除筛选，我们发现蛋白酶体是HRS-4642的增敏靶点。严格的体外和体内验证证实，HRS-4642与蛋白酶体抑制剂卡非佐米联合使用可增强肿瘤清除效果。此外，我们发现HRS-4642单独使用或联合使用可能增强KRAS G12D突变癌症的抗肿瘤免疫反应。

结果

HRS-4642是一种强效且选择性的KRAS G12D抑制剂

尽管针对KRAS G12C的药物现已可用于患者，但最常突变的RAS亚型，KRAS G12D仍然缺乏可行的治疗替代方案。针对这一挑战，基于合理设计和药效团优化，我们开发了一种新型支架化合物HRS-4642，（图1A）。HRS-4642是一种非共价抑制剂，对KRAS G12D具有高选择性和效力。表面等离子体共振（SPR）被用于测定HRS-4642与KRAS G12D、KRAS G12C或野生型KRAS蛋白之间的动力学和亲和力。在该实验中，SPR信号强度与传感器芯片上固定KRAS蛋白捕获的HRS-4642分子数量成正比，而较小的平衡解离常数表示更高的亲和力。SPR证实了HRS-4642与KRAS G12D的结合，其值为，大约比KRAS G12C低21倍，比野生型KRAS蛋白低17倍，为HRS-4642的应用提供了广泛的剂量窗口（图1B和S1A）。

HRS-4642以GDP和GTP结合形式与KRAS G12D结合（图S1B）。因此，它选择性地抑制了GDP负载的KRAS G12D与SOS1的相互作用，SOS1 是负责激活 KRAS 的关键鸟嘌呤核苷酸交换因子（KRAS G12D 和野生型 KRAS 蛋白的 IC50 分别为 0.72 和 14.98 nM；图 1C）。这导致在KRAS G12D突变细胞系中选择性抑制细胞RAS活性（IC50：AsPC-1和PC9中分别为2.329和822.2 nM；图1D）。HRS-4642还选择性抑制了GTP负载的KRAS G12D与RAF1的结合，RAF1是KRAS信号通路的关键下游效应器KRAS G12D 和野生型 KRAS 蛋白的 IC50 分别为 5.90 和 171.80 nM；图 1E）。此外，HRS-4642在携带KRAS G12D突变的细胞系中显示出剂量依赖性的细胞p-MEK和pERK水平抑制（图1F-1H和S1C-S1G）。当HRS-4642的浓度为时，GP2d、AGS和AsPC-1细胞系中的p-MEK水平升高，AGS和AsPC-1细胞系中的p-ERK水平增加（图1F、1G和S1D-S1G）。对p-ERK的抑制作用在给药后持续 h（图和S1I）。

此外，我们评估了HRS-4642对16种具有不同KRAS突变状态的人类细胞系活力的影响，包括G12D、G12C、G12V、G12S、G12A、G13D和野生型。HRS-4642在抑制KRAS G12D突变细胞系的生长方面表现出高选择性，IC50值范围从0.55到，而其他细胞系的IC50值范围从248.50到（图1l、1J、S1J和S1K）。总之，这些发现表明HRS-4642是一种强效且高度选择性的KRAS G12D抑制剂。

图1. HRS-4642在体外表现出对KRAS G12D的强效和选择性抑制

(A) HRS-4642 的结构式。

(B) SPR 传感器图显示了 KRAS G12D（左）、KRAS G12C（中）或野生型 KRAS（右）分别与 HRS-4642 的相互作用。相应的值已标注。

(D) 在 AsPC-1 和 PC9 细胞系中评估了 HRS-4642 对活性 RAS（包括 KRAS 和 HRAS）的抑制作用，浓度如所示。

(E) KRAS/RAF1 HTRF 结合分析显示了 HRS-4642 抑制 RAF1 与 GTP 加载的 KRAS G12D 或野生型 KRAS 蛋白结合的生化活性。

(F) 通过 Western 印迹分析评估了 GP2d 细胞系在 HRS-4642 处理下，指示浓度的 MEK、p-MEK、ERK 和 p-ERK 水平（nM）。

(G) 对 (F) 中条带的定量分析。

(H) 在 GP2d、AGS、NCI-H358 和 PC9 细胞系中确定了 HRS-4642 抑制 p-ERK 的 IC50 值。通过均相时间分辨荧光（HTRF）方法在给药 1 小时后评估 p-ERK 和总 ERK 水平。

(I) 剂量反应曲线展示了 HRS-4642 在具有 KRAS G12D 突变（上）或其他 KRAS 突变亚型和野生型（下）的不同人类癌细胞系中的活性。通过 CellTiter-Glo 3D 细胞活力测定法在给药 5 天后评估细胞活力。

(J) HRS-4642 在 (I) 中所示细胞系中的 IC50 值。数据为平均值标准差。另见图 S1。

HRS-4642抑制KRAS G12D突变癌症模型的肿瘤生长

为了评估HRS-4642的治疗效果，我们在免疫缺陷小鼠中建立了异种移植肿瘤模型，用于体内实验。我们评估了HRS-4642在携带KRAS G12D突变的AsPC-1（人胰腺癌）或GP2d（人结直肠癌）肿瘤的BALB/c裸鼠中的治疗效果。HRS-4642以不同剂量，每周通过静脉注射给药一次。在这两个模型中，与对照组相比，肿瘤生长受到剂量依赖性的显著抑制（图2A和2B）。此外，我们使用从接受过先前化疗的晚期LUAD患者获得的肿瘤组织，建立了一个KRAS G12D突变的PDX模型。值得注意的是，每周每公斤体重7.5或毫克的HRS-4642剂量在此模型中完全消除了肿瘤（图 2C）。此外，HRS-4642 在这些模型中表现出优异的安全性，表现为治疗期间小鼠体重稳定（图 2A-2C）。

基于这些发现，我们继续分析了 HRS-4642 在 BALB/c 裸鼠的 GP2d 异种移植模型中的药代动力学和药效学生物标志物。HRS-4642 以或的剂量给药一次。我们监测了给药后 HRS-4642 在血浆和肿瘤组织中的浓度，以及肿瘤组织中 p-ERK 的水平。我们观察到，提高 HRS-4642 的剂量会增加其在血浆和肿瘤组织中的浓度，并增强肿瘤组织中 p-ERK 的抑制作用（图 2D-2F）。接受 7.5 或剂量治疗的鼠中，p-ERK 的抑制作用持续长达一周（图 2F）。免疫组织化学（IHC）也显示 HRS-4642 具有强大的增殖抑制和凋亡促进作用（图 2G-2J）。通过 H&E 染色也证实了明显的抗肿瘤活性（图 2K）。此外，监测GP2d 模型在 HRS-4642 治疗 4 周后的血浆和肿瘤 HRS-4642 浓度（图 2B）。有趣的是，HRS-4642 倾向于在肿瘤中积累，导致其半衰期长（表 S1）。总的来说，这些结果表明，给药后可以维持高且持续的血浆和肿瘤 HRS-4642 浓度，从而持续抑制肿瘤 KRAS 信号传导。这为进一步的临床研究提供了依据。

图2. HRS-4642抑制KRAS G12D突变肿瘤的生长

(A-C) 已建立的 AsPC-1 (A)、GP2d (B) 或 LUAD PDX (C) 肿瘤在 BALB/c 裸鼠中分别以指定剂量接受载体或 HRS-4642 治疗。监测肿瘤体积（顶部）和体重（底部）。x 轴上的第 0 天代表治疗开始。，AsPC-1、GP2d 和 PDX 模型的样本数分别为 8。

(D-F) 在接种 GP2d 肿瘤的小鼠中，于 HRS-4642 治疗后的指定时间点测定血浆 (D) 或肿瘤 (E) 中的 HRS-4642 药代动力学，以及肿瘤组织中 p-ERK 与总 ERK 的比例 (F)。小鼠在每个时间点被安乐死以收集血液样本和肿瘤组织。

(G) AsPC-1 肿瘤在单次给予载体或 HRS-4642 (15 mpk) 5 天后的增殖标志物 p-ERK 和 Ki67 的代表性 IHC 染色图像。

(H) 对 (G) 中呈现的数据进行统计分析。

(I) (G) 中肿瘤的凋亡标志物 cleaved caspase3 和 cleaved PARP 的代表性 IHC 染色图像。

(J) 对 (I) 中呈现的数据进行统计分析。

(K) 肿瘤的 H&E 染色（G）。数据为平均值 SEM。。另见表 S1。

HRS-4642 在 KRAS G12D 突变型癌症患者中表现出抗肿瘤疗效

鉴于HRS-4642在临床前环境中展示出的强大效力和选择性，我们启动了一项多中心、开放标签、首次在人体中、针对携带KRAS G12D突变的晚期实体瘤患者的HRS-4642的1期研究（NCT05533463）。HRS-4642每周静脉给药一次，剂量在各组中逐步增加（图3A）。截至2023年10月17日数据截止时，我们在上海肺科医院最初的五个剂量组中已招募了9名非小细胞肺癌（NSCLC）患者。HRS-4642的给药在两名患者中导致了客观的部分缓解，并维持七名患者疾病稳定。

这两名应答者未携带其他常见的肺癌驱动基因突变，包括EGFR、ROS1、ALK、RET、BRAF、HER2、MET、NRAS和PIK3CA。对于应答者1，代表性病变在HRS-4642治疗6周后消失，疗效持续至 12 周。纵隔窗显示治疗后胸腔积液消失（图 3B）。对于响应者 2，轴向平面图像显示治疗后主要病灶大小显著减小。轴向平面和冠状平面图像均显示治疗后右上叶肺泡实变显著缓解（图 3B）。值得注意的是，两位达到部分缓解的患者此前在接受包括卡铂、培美曲塞、卡瑞利珠单抗、贝伐珠单抗和安罗替尼等多种系统治疗后病情进展（图 3C）。总之，我们的发现表明这些患者对 HRS-4642 有响应，这对 KRAS G12D 突变癌症患者来说是一个重要的里程碑。

图3. HRS-4642在KRAS G12D突变肿瘤患者中的临床活动

(A) 临床试验（NCT05533463）的剂量递增设计。

(B) 两名对HRS-4642有反应的NSCLC患者的治疗前和治疗后代表性CT扫描图像。响应者1的基线图像显示左肺下叶的病变（红色轮廓，黄色线测量）在肺窗和纵隔窗的胸腔积液（红色轮廓）。6周和12周扫描中的红色箭头指示基线病变和胸腔积液的位置。响应者2的基线图像显示右肺下叶的主要病变（轴向平面黄色线测量，肺窗）和右肺上叶的肺泡实变（轴向平面红色轮廓，纵隔窗）。6周扫描中的红色箭头指示肺泡实变的变化。

全基因组 CRISPR-Cas9 筛选描绘HRS-4642 的致敏和耐药性特征

KRAS 作为信号通路的核心调控因子，在信号转导中起着关键作用。然而，大多数 KRAS 抑制剂在临床环境中仅显示出中等的抗肿瘤疗效。为了识别 HRS-4642 的关键敏感化和耐药性特征，我们采用了一个全基因组 CRISPR-Cas9基因敲除文库，针对 18,986 个基因的 188,509 个单向导 RNA（sgRNA）（图 4A）。

首先，我们评估了HRS-4642在多种小鼠肺癌和胰腺癌细胞系中的功效和特异性，这些细胞系是否携带KRAS G12D突变。根据CCK-8结果，我们观察到HRS-4642显著抑制了KRAS G12D突变细胞（KP-1、KP-1-Clone 6、FC1242、FC1242-Clone 5和KP-3）的生存能力，IC50值范围从25.87到。然而，非KRAS G12D细胞Lewis肺癌（LLC）对HRS-4642治疗表现出耐药性，IC50值为2,171.00 nM（图4B）。

随后，我们进行了全基因组CRISPR-Cas9基因敲除筛选，以确定Cas9稳定表达的KP-1（KP-1-Clone 6）和FC1242（FC1242-Clone 5）细胞中参与HRS-4642致敏和耐药性的基因和通路（图S2A）。通过比较HRS-4642处理组与载体对照组，我们识别出sgRNA耗尽或富集的基因。所有基因及其相应的倍数变化（HRS-4642 vs. 载体）被用于进行通路富集分析。

关于基因，我们发现了来自KRAS上游和下游信号通路的KRAS 抑制经典敏感化靶点，包括FC1242细胞系中的Sos2、Nras、Raf1、Pik3r1和Akt3，以及Sos2、Raf1、Cdk4、Cdk6、Aurka以及 KP-1 细胞系中的 Pik3ca（图 4C 和 4D；表 S2）。我们进一步进行了体外组合测试，以验证针对选定基因候选物与 HRS-4642 的协同效应（图 S2B-S2G）。结果表明，抑制 Aurora 激酶 A（Ly3295668）和 Pi3k（alpelisib）的药物与 HRS-4642 显著协同（图 S2E 和 S2G），与先前在 KRAS G12C 靶向治疗中的报道一致。

此外，我们研究了在这两种细胞系中显著耗尽（标准化富集分数 [NES]<0，）或富集（NES ）的基因本体论（GO）通路。FC1242 和 KP-1 中分别有 442 和 439 条耗尽通路，其中有 18 条通路重叠（图 4E ；表 S3）。值得注意的是，我们发现这 18 条 GO 通路中有 5 条与蛋白酶体相关（图 4F）。同样，我们分析了这两种细胞系中富集的 GO 通路，并确定了 45 个共同富集的 GO 术语（图 4E、4G 和 S2H；表 S3）。对于所有包含的通路（GO、KEGG、REACTOME、HALLMARK 和 CORUM），在 FC1242 和 KP-1 中分别识别出 15 和 8 条耗尽的蛋白酶体相关通路（图 S2I；表 S4）。

富集分析的结果表明，针对蛋白酶体可能增强 HRS-4642 在不同组织背景的肿瘤模型中的疗效。基于这一观点，我们进一步探讨了蛋白酶体特征与癌症患者生存之间的关系（图S3A-S3F）。使用中位表达水平作为分界值，我们发现蛋白酶体特征的低表达与泛癌和LUAD患者的总生存期和无病生存期显著延长相关（图S3A-S3E）。在胰腺癌患者也中观察到类似趋势，但由于样本量较小，统计学意义不显著（图S3C和S3F）。总的来说，我们的结果表明蛋白酶体可能潜在地被用作HRS-4642的增敏靶点。

图4. 全基因组CRISPR-Cas9筛选确定蛋白酶体抑制作为HRS-4642的协同策略（A）全基因组CRISPR-Cas9筛选的策略。

(B) HRS-4642 在小鼠细胞系中的剂量反应曲线，包括 KRAS G12D 突变的 KP-1、KP-1 克隆 6（稳定表达 Cas9）、FC1242、FC1242 克隆 5（稳定表达 Cas9）和 KP-3，以及 KRAS G12C 突变的 LLC 细胞。

(C 和 D) 火山图展示了在 FC1242（C）或 KP-1 细胞系（D）中，敲除（KO）增强（蓝色）或抑制（红色）对 HRS-4642 治疗敏感性的基因。

(E) 维恩图描绘了 FC1242 和 KP-1 细胞系中耗尽（顶部）或富集（底部）的 GO 通路数量。

(F 和 G) 气泡图展示了 FC1242 和 KP-1 细胞系中共同耗尽的 18 条（F）和前 20 条共同富集的（G）GO 通路。另见图 S2、S3、表 S2-S4 和 S7。

蛋白酶体抑制剂卡非佐米与HRS-4642协同降低肿瘤细胞活力

泛素-蛋白酶体系统的功能障碍，影响细胞周期调控、生长、增殖、凋亡、DNA修复以及其他与恶性肿瘤密切相关的细胞信号传导过程，似乎是癌症治疗的潜在靶点。为了检验HRS-4642与蛋白酶体抑制剂（卡非佐米）之间的潜在协同作用，我们在FC1242、SK-LU-1、KP-1、A427和AsPC-1细胞系以及KRAS G12D突变的LUAD患者衍生的类器官模型中进行了协同分析。这些模型中的协同分数分别为，以及24.97，表明除KP-1外，均显示出一致的协同相互作用，但在KP-1中观察到相加作用（图5A-5D和S3G-S3I）。Western blot进一步证实了联合用药对KRAS下游信号通路的抑制作用增强（图5E-5G）。此外，单独使用HRS-4642治疗后观察到蛋白酶体活性的抑制作用，而与卡非佐米联合使用时抑制作用更强（图）。总的来说，这些结果表明蛋白酶体抑制剂卡非佐米显著增强了HRS-4642的体外治疗效果。

图5. 蛋白酶体抑制剂卡非佐米与HRS-4642的体外协同作用

(A–C) 卡非佐米的剂量-反应曲线（左上）或HRS-4642的剂量-反应曲线（左下），以及卡非佐米与HRS-4642在FC1242（A）、SK-LU-1（B）或KP-1（C）细胞系中的生长抑制矩阵（右）。

(D) FC1242、SK-LU-1或KP-1细胞经载体、HRS-4642、卡非佐米（4 nM）或联合处理48小时后的细胞活力。HRS-4642对FC1242、SK-LU-1和KP-1细胞的浓度分别为50、10和。

(E-G) 通过Western blot分析显示，在(D)中FC1242、SK-LU-1或KP-1细胞系中p-ERK的抑制情况。

(H) 在(D)中所有治疗组的蛋白酶体活性测定。数据为平均值 SEM。* ；** ；*** ；**** 。另见图S3。

蛋白酶体抑制剂卡非佐米增强 HRS-4642 的体内抗肿瘤疗效

为了研究卡非佐米和HRS-4642的联合治疗效果，我们在小鼠模型中进行了一系列治疗实验（图6A-6D和S3J-S3O）。HRS-4642对FC1242肿瘤的生长没有影响。然而，当与卡非佐米联合使用时，它抑制了肿瘤生长而不影响小鼠体重（图6A）。同样，与HRS-4642或卡非佐米单药治疗相比，联合HRS-4642和卡非佐米对KP-1和AsPC-1皮下肿瘤以及KP-1原位模型中的肿瘤生长显示出更强的抑制效果（图6B、6C、S3J和S3K）。此外，作为KRAS下游的p-ERK在HRS-4642单药治疗和联合治疗组中通过IHC染色检测到显著下调（图S3L和S3N）。Ki67在HRS-4642或卡非佐米单药治疗后显著下降，而在联合治疗组中下降更为明显（图S3L和S3N）。HRS-4642治疗还导致凋亡信号通路的显著上调，表现为cleaved caspase-3和cleaved-PARP的增加，并且这种效果在与卡非佐米联合使用时进一步增强（图S3M和S3O）。H&E染色还显示，HRS-4642单药治疗后肿瘤侵袭性显著降低，且呈剂量依赖性，在与卡非佐米联合使用时更为明显（图6D）。这些结果表明，HRS-4642的体内抗肿瘤功效可以通过靶向蛋白酶体来提高。

HRS-4642单独或与卡非佐米联合触发抗肿瘤免疫反应

先前的一项研究表明，抑制KRAS G12C有可能通过阻断KRAS下游通路重塑肿瘤免疫微环境。在此，我们还发现HRS-4642对免疫缺陷的BALB/c裸鼠接种的KP-1肿瘤的疗效不如对免疫健全的C57BL/6小鼠显著（图6B和S3P-S3R）。此外，HRS-4642或其与卡非佐米的组合在体内比体外在KP-1模型中显示出更强的疗效（图5C和6B）。基于这些发现，我们推测KRAS G12D抑制也可能影响抗肿瘤免疫。

因此，我们对接受HRS-4642和/或卡非佐米治疗的KP-1肿瘤进行了免疫特征分析（图6E-6M，S4和S5A-S5R）。流式细胞术分析显示，接受HRS-4642单药治疗或与卡非佐米联合治疗的组中，和白细胞的比例显著增加（图6F，6G和61）。值得注意的是，效应细胞群或细胞）在HRS-4642单药治疗组和联合治疗组中也显著增加（图和）。此外，经典的T细胞功能标志物，干扰素和颗粒酶，在联合治疗组的细胞中上调，但在HRS-4642单药治疗组中未见上调（图和）。

尽管两组中的浸润均未增加，HRS-4642 显示出促进细胞激活的趋势，这在联合组中进一步增强（图 S5E 和 S5F）。我们还检查了髓系细胞，发现巨噬细胞浸润在 HRS-4642 单药治疗组和联合治疗组中被抑制（图 S5H），但 M1 样巨噬细胞的特征在 HRS-4642 单药治疗和联合组中明显增加（图 6M、S5I 和 S5J）。然而，无论是单药治疗还是联合治疗均不影响髓源性抑制细胞和树突状细胞（DCs）的比例（图 S5K 和 S5L）。同样，免疫组化染色也发现 HRS-4642 单药治疗或与卡非佐米联合可以改善免疫浸润（图 S5S-S5Z）。

简而言之，HRS-4642，尤其是与卡非佐米联合使用时，有可能重塑肿瘤免疫微环境，促进具有抗肿瘤特性的免疫细胞的浸润和激活。

图6. HRS-4642与卡非佐米协同作用并重塑肿瘤免疫微环境

(A-C) FC1242(A)、KP-1 (B) 或 AsPC-1 (C) 肿瘤分别接受载体处理（每周四次）、HRS-4642（3.75 mpk，每周一次）、卡非佐米（FC1242 和 KP-1 肿瘤为 9 mpk，AsPC-1 肿瘤为，每周三次）或联合治疗三周。记录肿瘤体积（顶部）和体重（底部）。轴上的第 0 天代表肿瘤接种日。。

(D) 经过三周指定治疗后的 KP-1 肿瘤的 H&E 染色。

(E) 治疗三周后采集的肿瘤中 CD45 群体的代表性流式细胞分析。5 周龄的 C57BL/6 小鼠皮下植入 KP-1 肿瘤，并接受载体处理（每周四次）、HRS-4642（3.75 mpk，每周一次）、卡非佐米（9 mpk，每周三次）或联合治疗三周。。

(F-M) CD45 群体在所有活细胞中的百分比 (F)，CD4 T 细胞在 CD45 群体中的百分比 (G)，CD44 CD62L 群体在 CD4 群体中的百分比 (H)，CD8 T 细胞在 CD45* 群体中的百分比 (I)，CD44*CD62L* 群体在 CD8* 群体中的百分比 (J)，IFNγ* (K) 或 GZMB* (L) 群体在 CD8* 群体中的百分比，以及 M1 样巨噬细胞在活细胞中的百分比 (M)。数据为平均值 SEM。ns 表示无显著性；* ；** ；*** ；**** 。另见图 S4 和 S5。

卡非佐米通过抑制 Notch4 信号传导和增强干扰素 α 反应与 HRS-4642 协同作用

Mohanty等人最近的一项研究表明，粘着斑复合体和Wnt/β-catenin信号通路在介导KRAS G12C抑制剂的获得性耐药中发挥重要作用，这一耐药性可通过卡非佐米缓解。然而，上述基因（包括ltgb4、Pxn、Wnt2和Ctnnb1）及通路（粘着斑组装和Wnt/ -catenin信号）对HRS-4642并未显示出显著的增敏或耐药潜能（图S6A-S6F）。这些发现表明，在我们的研究背景下，Wnt/β-catenin通路的抑制可能并不有助于卡非佐米与HRS-4642之间的协同作用。

为了识别卡非佐米/HRS-4642药物对的协同机制，我们对KP-1细胞进行了RNA测序（RNA-seq）和数据非依赖性采集蛋白质组学分析，这些细胞分别接受了载体、HRS-4642、卡非佐米或联合治疗（表S5）。通过富集分析，我们确定了77条在联合治疗组而非HRS-4642单药治疗组中，在RNA和蛋白质水平上显著改变的通路（图7A、7B和S6G-S6J）。在这些通路中，“NOTCH4信号传导的负调控”显著上调（图7B和S61）。我们进一步证实了联合治疗组中Notch4的下调，以及增强的细胞凋亡（图7C和S7A）。由于Notch4已被广泛报道调控癌症干细胞特性、上皮-间质转化和治疗抵抗，我们推测卡非佐米可能通过下调Notch4信号与HRS-4642产生协同作用。我们进一步发现，敲除Notch4显著增加了KP-1细胞对HRS-4642的敏感性（图S7B和S7D），并且泛Notch抑制剂BMS-906024能够与HRS-4642产生协同作用（图S7C和S7D）。这些结果表明，Notch4信号的下调部分解释了这两种药物之间的协同作用。

此外，我们发现“HALLMARK_INTERFERON_ALPHA_RESPONSE”通路在HRS-4642和卡非佐米单药治疗组中显著上调，并且相较于每种药物，联合治疗进一步增强了这一效应（图7E-7G）。逆转录PCR（RT-PCR）的数据也显示了干扰素α反应通路中基因表达模式的一致性（图7H-7L）。鉴于I型干扰素通过直接作用于肿瘤细胞或间接作用于免疫细胞可发挥强大的抗肿瘤效应， HRS-4642和卡非佐米可能通过增强干扰素α反应而协同作用。此外，我们通过RNA-seq和RT-PCR检测了KP-1细胞在载体、HRS-4642、卡非佐米或联合治疗下的细胞因子与趋化因子表达水平。Cxcl16是一种趋化因子，据报道与细胞浸润、激活和存活呈正相关，在HRS-4642组和联合治疗组中明显上调（图7M和S7E ），这为免疫谱分析和免疫组化分析中的观察结果提供了一种可能的解释。

总之，我们的数据表明，联合治疗组中Notch4信号的下调和干扰素α反应的增强可能突显了 HRS-4642 和卡非佐米之间的协同作用。

图 7. 卡非佐米通过抑制 Notch4 信号传导和增强干扰素-α 反应途径与 HRS-4642 协同作用 (A) 当使用 HRS-4642 或联合用药处理时，在 RNA 或蛋白质水平上显著改变的途径。在联合用药组中鉴定出 73 条上调途径和 4 条下调途径，而在 HRS-4642 组中没有变化。

(B) 在(A)中上调的73条通路中，前20条通路的RNA富集分析结果，比较了联合组与对照组的差异。灰色填充的点代表q值为零。

(D) HRS-4642抑制对照组或Notch4敲除KP-1细胞的剂量-反应曲线。

(E) 维恩图显示了指定比较中在RNA水平上显著改变的通路。

(F) 在(E)中的五次比较中出现的14条通路。

(G) 干扰素α反应通路中基因的表达水平。

(H-M) KP-1细胞用对照组、HRS-4642（200 nM）、carflizomib（200 nM）或联合处理48小时，并使用RT-PCR评估lf30（H）、lrf7（I）、Ddx60（J）、Trim12a（K）、ll7（L）和CxcI16（M）的表达水平。数据为平均值±SEM。ns表示无显著性；*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；****p＜0.0001。

另见图S6、S7和表S5。

讨论

在本研究中，我们开发了一种高亲和力、选择性、长效且非共价的KRAS G12D抑制剂HRS-4642，该抑制剂在体外和体内均显示出对KRAS G12D突变癌症的强大疗效。重要的是，在第1期临床试验中，HRS-4642在剂量递增队列中显示出有希望的抗肿瘤疗效。此外，全基因组CRISPR-Cas9筛选揭示了HRS-4642的敏感性和耐药性谱，并首次发现蛋白酶体抑制剂卡非佐米作为增敏剂具有协同作用。另外，HRS-4642治疗，尤其是与卡非佐米联合使用，有效地重塑了肿瘤微环境，使其趋向于更有利的免疫状态。综上所述，本研究为缺乏有效治疗的KRAS G12D突变癌症患者提供了潜在的新疗法。

KRAS G12D 是最常见的致癌 KRAS 亚型突变。随着 KRAS G12C 抑制剂的成功开发、对不同 KRAS 突变核苷酸循环动力学以及 KRAS 开关-II 口袋关键结构元件的深入理解，科学家们一直在考虑开发针对其他 RAS 突变体的抑制剂。MRTX1133 是基于结构理解设计的 KRAS G12D 选择性抑制剂，关键的开关-II 口袋结合相互作用在 KRAS 变体中是保守的，结合小分子取代基与质子化胺部分靠近酸性侧链 Asp 12 可以产生有效的相互作用，从而驱动对该突变蛋白的选择性。同样，HRS-4642 作为一种强效、长效且非共价的 KRAS G12D 抑制剂，显示出高亲和力（亲和常数为），并在体外和体内对 KRAS G12D 突变癌症表现出强大的疗效。更重要的是，我们在剂量递增队列中观察到非小细胞肺癌（NSCLC）患者的应答者，这表明针对 KRAS G12D 突变癌症的靶向治疗时代前景广阔。然而，我们的临床试验结果还存在以下局限性。首先，由于入组病例数量有限，我们尚未报告 HRS-4642 对 NSCLC 以外的其他肿瘤的疗效。随着更多病例的入组，我们将提供其特定抗肿瘤效果的进一步更新。其次，在我们的报告中，仅有（2/9）名 NSCLC 患者对 HRS-4642 有反应，这可能是由于 HRS-4642 的剂量不足。在九名患者中，三名接受了，三名接受了，两名接受了，一名接受了的 HRS-4642 每周治疗，应答者 1 和应答者 2 分别来自和剂量组。最后，反应深度不足，表明联合治疗的合理性和必要性。

然而，KRAS G12D 与 G12C 的异质性或背景致癌驱动因素可能会削弱靶向治疗的疗效。通过全基因组 CRISPR-Cas9 筛选，我们研究了可能增强 HRS-4642 抗肿瘤效应的潜在基因或通路。基于耗竭和富集 sgRNAs 的富集分析，我们全面绘制了增强和抵抗 HRS-4642 的基因和信号通路谱。与 KRAS G12C 抑制剂的发现一致，PI3K 或 AURKA 抑制也被发现能提高 HRS-4642 的疗效。更重要的是，我们首次观察到 HRS-4642 与蛋白酶体信号通路抑制剂卡非佐米（一种获 FDA 批准用于多发性骨髓瘤的药物）联合使用时，能协同增强肺癌和 PDAC 细胞系的敏感性。与我们的结果一致，最近的一项研究也发现卡非佐米在 KRAS G12C 突变的细胞系中与索托拉西布表现出协同作用。这些发现表明蛋白酶体通路在 KRAS 突变型癌症中起着至关重要的作用。

蛋白酶体是泛素-蛋白酶体系统中的关键组成部分，负责细胞内蛋白质的降解。其抑制剂，如硼替佐米和卡非佐米，已被批准用于治疗血液系统恶性肿瘤。尽管蛋白酶体抑制剂在临床上已应用数十年，但这些药物的复杂机制尚未被完全理解。在我们的研究中，我们还验证了HRS-4642与卡非佐米在KRAS G12D突变癌症模型中的体外和体内协同效应。重要的是，与我们的发现一致，一项2期临床试验中发现，硼替佐米单药治疗在KRAS G12D突变肺癌患者中达到了的客观缓解率。同样，Mohanty等人最近发现，蛋白酶体抑制剂通过下调ITGB4和 -catenin表达与索托拉西布表现出协同作用。然而，这些机制在我们的研究中未得到验证。相反，我们发现Notch4信号的下调和干扰素α反应的上调可能是协同效应的潜在原因。综上所述，这些发现表明蛋白酶体抑制剂可能增强HRS-4642的抗肿瘤效果，这种联合策略值得进一步研究。

值得注意的是，KRAS不仅诱导肿瘤增殖，还影响免疫微环境，进而促进癌症进展。已经发现，首个获得FDA批准的KRAS G12C抑制剂索托拉西布，不仅有效抑制肿瘤生长，还显著增加了肿瘤内细胞的浸润、巨噬细胞和DCs中。当与PD-1抗体联合使用时，其治疗效果更为显著。据报道，共价KRAS G12C抑制剂可通过主要组织相容性复合体Ⅰ类呈递药物修饰的新抗原。受这些发现的启发，我们还研究了HRS-4642对肿瘤免疫反应的影响，发现HRS-4642能显著促进和细胞的浸润并提高其免疫激活。此外，B细胞的激活标志物CD27在肺癌模型中也显著增加，这与最近关于MRTX1133对胰腺癌肿瘤微环境影响的报告一致。更有趣的是，当HRS-4642与卡非佐米联合使用时，关键免疫细胞的浸润比例也显示出增加趋势，表明HRS-4642，尤其是与卡非佐米联合使用，加上ICIs（免疫检查点抑制剂）可能是KRAS G12D突变实体瘤的潜在策略。

总之，本研究标志着一种高亲和力、选择性、长效且非共价KRAS G12D抑制剂HRS-4642的开发。该药物在体外和体内对KRAS G12D突变癌症均显示出高效力，并在临床环境中显示出有希望的抗肿瘤效果。我们还检测到它与蛋白酶体抑制剂的协同效应。因此，我们预期新型KRAS G12D抑制剂，如HRS-4642，将为携带KRAS突变的癌症患者治疗带来另一个突破。

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翻译及审校：圣鹏飞

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