1、shRNA的原理
短发夹RNA（shRNA）是一种具有环状结构的分子，其设计合成的序列能够在细胞内转录和产生与目标mRNA特定区域互补的siRNA。这些siRNA与目标mRNA结合，通过RNA干扰（RNAi）机制介导靶向mRNA的降解，从而调控基因表达。
其作用原理基于RNA干扰（RNA interference, RNAi）机制。首先，设计和合成具有特定序列的shRNA。一旦引入到细胞内，shRNA被细胞的RNA干扰机制识别并与RNA诱导沉默复合物（RISC）结合。随后，RISC将shRNA引导到目标mRNA上，并与其互补配对。这一过程会导致目标mRNA的降解或转录抑制，从而阻断目标基因的表达。通过这种方式，shRNA可以有选择性地沉默特定基因的表达，从而实现基因功能研究和潜在的治疗应用。
如何设计shRNA序列并将其构建在载体上呢？
一般会在PLKO.1-puro载体的U6启动子区域之后将shRNA序列插入，而pLK-puro空载体上用于连接shRNA的两个酶切位点分别是AgeI和EcoRI
即shRNA序列应该为：
最终，我们需要确定能够针对目标基因的Sense序列，然后将该序列进行补全即可得到目标shRNA序列：
2、设计步骤
（1）设计shRNA
以鼠FTO基因为例设计shRNA，打开shRNA设计网站https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/semi-configurators/shrna?activeLink=productSearch
输入目的基因，点击查找：
选择所需物种，查看敲低率，并且很多都是已经验证了的，所显示的靶标序列即为我们需要的sense序列。
之后找到此序列的反向互补序列，网址：https://www.detaibio.com/sms2/rev_comp.html，输入sense序列，点击submit
即可得到antisense序列
填补sense序列和antisense序列：
互补链可继续互补（互补不反向）
这时FTO的shRNA就设计好了，最后将设计好的两条Oligo送给公司合成，然后进行适当的退火，即可形成shRNA的双链结构，进而与载体连接，为后续实验提供必要的基因沉默工具。
（2）设计PLKO.1-puro-FTO-shRNA质粒图谱
PLKO.1-purod 空载图谱可以继续在生物医学之家的addgene里面查找，如下图所示，还需要知道AgeI与EcoRI的酶切位点，AgeI的酶切位点是accggt，EcoRI的酶切位点是gaattc
为了将shRNA成功插入到PLKO.1载体中，我们需要确保shRNA序列的两端分别含有AgeI和EcoRI的酶切位点序列，分别为"accggt"和"gaattc"，以便进行后续的酶切和连接操作。
shRNA的序列如下，开头是CCGGC，并不是ACCGGT，所以要将CCGGC变为ACCGGT(注意小写，后面方便我们删除加的碱基)，并且在尾巴我们我们只看到一个G，所以我们要将G变为Gaattc:
之后复制改后的序列，粘贴到snapgene中
这时可以观察到shRNA序列已经包含了两个特定的酶切位点，并将其保存为FTOshRNA需要插入的序列。这样一来，就可以与PLKO.1进行酶切后的连接操作。
接下来, 选中PLKO.1-puro的两个位点，随后点击插入片段：
点击片段，将刚刚保存的FTOshRNA片段拖入，右侧通过AgeI和EcoRI这两个酶切位点去碰撞，点击克隆：
即组装好了，再次点击这两个位点，点击序列，这时shRNA进去了，但是多了一个t，选中之后按delete键。
为了以防错误，我们将设计好的shRNA序列复制，然后回到组装好的质粒上图谱上，按住ctrl+F，再Ctrl+V粘贴，搜索看是否存在，存在的话就会被选中：
之后将图谱保存就好了，设计完成。
3、注意事项
(1) RNA聚合酶IIII型启动子终止信号常见于Poly(T)结构，因此设计shRNA时需要避免靶向序列中连续出现四个及以上的T碱基。
(2) 当选择U6或7SK启动子时，建议靶向序列以G碱基开头，以获得最佳的表达效果。
(3) 可多设计几条shRNA序列, 提高基因沉默的效率。
本文作者是"小米"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
文稿：小米
校对：煲仔饭
素材：Canva
参考资料：
Fouquerel, Elise & Li, Jianfeng & Braganza, Andrea & Yu, Zhongxun & Brown, Ashley & Wang, Xiao-Hong & Schamus, Sandra & Svilar, David & Fang, Qingming & Sobol, Robert. (2014). Use of RNA Interference to Study DNA Repair. 10.1007/978-1-4939-1068-7_24.
https://www.linkedin.com/pulse/chemically-modified-short-hairpin-rna-shrna-luke-mclaughlin-vphrf
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