他山之石 Plant J｜敲除β-伴大豆球蛋白的亚基可以改变种子的蛋白质组成，并提高大豆的耐盐性

学术 2024-10-17 09:01 浙江

大豆中含有大约35-40%的蛋白质和多种人类无法直接合成的必需氨基酸,因此成为了全球重要的植物蛋白来源。然而,两种含硫氨基酸(半胱氨酸和蛋氨酸)在大豆中的含量较低,这严重影响了大豆蛋白在人类和动物中的利用效率。

7S和11S球蛋白(globulin)是大豆中最重要的蛋白质组分,也是影响大豆品质性状的主要因素。其中,7S球蛋白包含了五种亚基(α'、α、β、γ和B0-伴大豆球蛋白),由于他们的分子量都超过了42 kDa,使得7S球蛋白成为了大豆蛋白致敏的关键因素。而超过50%的7S球蛋白是β-伴大豆球蛋白,它通常以α、α'和β亚基的三聚体形式存在。另外,11S球蛋白包含了六种酸性和五种碱性亚基,它们的分子量在20-42 kDa之间。与7S球蛋白不同,11S球蛋白含有较高含量的含硫氨基酸,占总氨基酸残基的3-4.5%。因此,通过降低7S球蛋白的含量和提高11S/7S的比例,可以减少过敏性和增加含硫氨基酸的含量,进而提高大豆品质。

世界上超过20%的可耕地是由高盐土壤组成,土壤盐碱化已成为全球农业生产和分配的主要威胁。为了确保在盐碱土地上作物的产量,有必要提高大豆品种的耐盐性。

2024年10月9日,The Plant Journal上线了一篇关于β-伴大豆球蛋白的研究论文“Knockdown of β-conglycinin α′ and α subunits alters seed protein composition and improves salt tolerance in soybean”。该研究通过GWAS和RNA-Seq分析,鉴定了编码β-伴大豆球蛋白α'亚基的基因GmCG-1,并通过代谢组分析阐释了GmCG-1及其旁系同源基因的敲除导致大豆蛋白组分变化和耐盐性提高的分子机制。

1. GmCG-1的遗传鉴定以及GmCG-1、GmCG-2和GmCG-3敲除突变体的生成

为了调查大豆种子中球蛋白谱的遗传变异,该研究使用了β-伴大豆球蛋白(7S)含量、球蛋白(11S)含量、糖球蛋白与β-伴大豆球蛋白的比例(RGC, 11S/7S)以及糖球蛋白和β-伴大豆球蛋白的总和(SGC, 11S+7S)作为指标,在三个环境中(2015年、2016年和2017年)对自然群体(由24个优良品种和195个不同地理来源和表型的当地品种组成)进行了全基因组关联研究(GWAS)。

通过分析这四个性状在自然群体中的变异系数和单核苷酸多态性(SNPs),在第10条染色体上发现了一个明显的SNP簇,与RGC(11S/7S)呈高度关联(图1a)。此外,结合之前含硫氨基酸含量不同的两个大豆品种的转录组数据,分析了第10条染色体上所有SNPs的20-kb范围内的107个基因,并在含硫氨基酸含量极低的品种中发现了8个高度表达的基因(图1b)。

其中,关键基因GmCG-1(Glyma.10g246300)编码β-伴大豆球蛋白α'亚基,比其他选定的差异表达基因(DEGs)更特异地在种子发育的不同阶段表达(图1c)。而Glyma.20g148400(编码GmCG-2和GmCG-3)是大豆中GmCG-1的旁系同源基因,它编码β-伴大豆球蛋白α亚基,故被一起选为后续功能研究的对象。

随后,通过设计的多重CRISPR-Cas9载体,获得了两个纯合敲除系(ko-1和ko-2),它们具有β-伴大豆球蛋白α和α'亚基的多个突变版本(插入和缺失),这些联合突变导致GmCG-1、GmCG-2和GmCG-3蛋白的C末端氨基酸序列改变,进而提前终止翻译过程(图1d,e)。

图1. GmCG-1的遗传定位及纯合突变体(ko-1, ko-2)的突变类型

2. β-伴大豆球蛋白α和α'亚基的敲除改变了种子储存物质含量

在田间实验中,突变体与野生型(WT)在主茎节数、荚数、种子数、百粒重或每株产量方面没有差异；然而,突变体的植株高度低于WT(图2a)。因此,β-伴大豆球蛋白α和α'亚基的敲除对产量相关性状没有显著影响。

染色和定量检测结果表明,突变体种子的总蛋白含量比WT种子高出5.08和5.21%(图2b,c)。而SDS-PAGE分析显示,突变体种子在与β-伴大豆球蛋白的α, α'亚基(71-76 kDa)对应的条带明显比WT更弱(图2d),其含量分别下降了54.29%和72.95%,而11S/7S比值显著上升,分别上升了179.21%和337.01%(图2e)。正如预期的那样,突变体中的蛋氨酸含量增加了4.96%和6.06%,半胱氨酸含量增加了8.90%和7.72%(图2f)。而大多数其他氨基酸也在突变体种子中发生了变化。

此外,两个ko品系的油含量显著低于WT(图2g,h),其中硬脂酸(C18:0)和亚油酸(C18:3)的含量显著增加,而油酸(C18:2)的含量显著下降。与WT种子细胞中油体(OBs)的均匀分布相比,在突变体种子细胞中沉积的OBs分布较少,并在边缘积累。

以上结果表明,敲除Gm7Sα′ (CG-1)和Gm7Sα (CG-2, CG-3)改善了大豆种子的营养组成。

图2. 敲除β-伴大豆球蛋白α和α′亚基对种子储存物质含量的影响

3. β-伴大豆球蛋白α和α'亚基的敲除促进了大豆的耐盐性

令人惊讶的是,球蛋白突变体在发芽和幼苗阶段均表现出耐盐性,而关于大豆种子蛋白组成与盐胁迫响应之间的关系知之甚少。代谢组学和RNA-seq分析表明,与野生型相比,突变体通过更类似于活性水杨酸生物合成的途径形成；然而,细胞分裂素的合成表现出更大的缺陷,这可能导致植物抗旱相关耐盐蛋白和细胞膜离子转运蛋白的表达增加。

为了探究突变体中含硫氨基酸含量的增加是否能够赋予耐盐性,该团队用150 mM盐溶液,处理了具有最高含硫氨基酸水平的ko-2,并评估了发芽和幼苗阶段种子的生长状态。当WT和ko-2种子在不含NaCl(0 mM)的对照溶液中发芽时,两种基因型的下胚轴长度相似。然而,在150 mM盐处理7天后,ko-2的下胚轴长度显著大于WT(图3a,b)。

在同一阶段,与WT组相比,ko-2组的丙二醛(MDA)含量在盐胁迫后显著降低。相反,ko-2突变体中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性显著高于WT下胚轴,进一步表明ko-2种子的耐盐性大于WT种子在发芽期间的耐盐性。

进一步分析表明,在幼苗阶段,经过NaCl处理后,ko-2植株的地上部分长度、根长、根投影面积(PA)、侧根数量、根体积和平均叶绿素含量显著大于WT(图3d,e)。

此外,还比较了植株中K⁺和Na⁺的积累。在未处理的条件下,ko-2的根部Na⁺水平较低,地上和地下部分的K⁺水平较高。经过盐处理后,ko-2比WT根系中的Na⁺含量显著降低,地上部分的K⁺含量显著增加,这显著降低了ko-2在盐处理条件下的Na⁺/K⁺,提高了ko-2的耐盐性(图3f)。

图3. β-伴大豆球蛋白α和α′亚基的敲除提高了大豆的耐盐性

4. 代谢组分析揭示了β-伴大豆球蛋白α和α'亚基的敲除通过影响植物激素途径提高了大豆植株的耐盐性

信号激素及其下游信号分子在植物的耐盐性中扮演着重要角色,因此推测种子储存物质的变化会改变种子中其他代谢物质的产生和积累,而这又影响了突变体的耐盐性。

通过在WT和突变体ko-2之间进行代谢组学分析,共检测到213种不同的代谢物。KEGG富集分析揭示,ko-2和WT之间差异丰富的代谢物富集在氨基酸代谢途径中,如β-丙氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸、酪氨酸和色氨酸。除了氨基酸代谢途径外,黄酮类生物合成、异黄酮生物合成、糖酵解/糖异生、植物激素信号转导等也显著富集(图4a)。

在KEGG代谢途径的前50种差异丰富的代谢物中(图4b),突变体中的L-谷胱甘肽(GSH)的含量显著增加。此外,芒柄黄酮、黄豆苷和染料木素参与异黄酮生物合成途径。檞皮素参与黄酮类生物合成途径。水杨酸(SA)和反式玉米素在植物激素信号转导途径中富集。SA,最常见的逆境植物激素信号,含量在突变体中增加,而反式玉米素(一种存在于高等植物中的天然植物细胞分裂素)的含量在突变体中减少。

为了进一步确定植物激素在大豆植物耐盐反应中的作用,检测了ko-2和WT植物在盐处理7天后根中的植物激素含量。结果显示,ko-2中的细胞分裂素(CK)相关激素的水平显著降低(图4c)。这些结果表明,Gm7Sα′(CG-1)和Gm7Sα (CG-2, CG-3)的敲除改变了内源激素的合成,内源CK水平的降低提高了突变体的耐盐性。

图4. β-伴大豆球蛋白α和α′亚基的敲除影响了内源植物激素的合成

5. 在大豆驯化过程中选择了GmCG-1、GmCG-2和GmCG-3

种群演化分析表明(图6),GmCG-1、GmCG-2和GmCG-3在大豆驯化过程中被选择。含有GmCG-1Hap1的大豆品系,呈现出较高的11S/7S比率和较高的耐盐性,应进一步被利用。

图6. 大豆驯化过程中选择了Gm7sa (GmCG-1)的一个自然变异体

总之,敲除β-伴大豆球蛋白α和α'亚基可以提高大豆种子的营养价值,并增加大豆植物的耐盐性,为设计具有高营养价值和高耐盐性的大豆品种提供了策略。

原文连接：https://doi.org/10.1111/tpj.17062

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