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据世界卫生组织（WHO）统计，每年有180万至270万人因毒蛇咬伤而受到影响，其中约10万人因此丧生，另有三倍于此的人群永久残疾，包括失去肢体。大多数伤害发生在非洲、亚洲和拉丁美洲，这些地区脆弱的医疗体系加剧了这一问题。
目前，用于治疗蛇咬伤患者的抗蛇毒血清全部来自动物血浆，但这类治疗成本高昂、疗效有限且副作用明显。此外，不同蛇种的毒素差异巨大，需要根据世界各地的具体情况量身定制治疗方案。然而，近年来，科学家对蛇毒的理解进一步加深，并开发了新的方法来对抗其毒性影响。其中一项突破性成果已于1月15日发表在《自然》杂志上。
这一研究由2024年诺贝尔化学奖得主、华盛顿大学医学院的戴维·贝克（David Baker）和丹麦技术大学（DTU）的蒂莫西·帕特里克·詹金斯（Timothy Patrick Jenkins）领导的团队完成。他们利用深度学习工具设计出能够与致命眼镜蛇毒素结合并中和其毒性的全新蛋白质。
蛇咬伤中毒仍是一种破坏性极大的被忽视的热带疾病，每年导致超过10万人死亡，并引发严重并发症和长期残疾。三指毒素（3FTx）是眼镜蛇毒中的高毒性成分，可引起多种病理，包括严重的组织损伤和对烟碱型乙酰胆碱受体的抑制，从而导致危及生命的神经毒性。目前，治疗蛇咬伤的唯一手段是来自免疫动物血浆的多克隆抗体，但其成本高昂，且对三指毒素的疗效有限。在本研究中，研究人员利用深度学习方法，从头设计出能够结合三指毒素家族中短链和长链α-神经毒素及细胞毒素的蛋白质。通过有限的实验筛选，我们获得了具有卓越热稳定性、高结合亲和力和接近原子级精确度的蛋白设计。这些设计的蛋白在体外有效中和了三种三指毒素亚家族，并成功保护小鼠免受致命神经毒素攻击。如此高效、稳定且易于制造的中和毒素蛋白为更安全、成本更低、可广泛获取的下一代抗蛇毒疗法奠定了基础。除蛇咬伤外，研究结果还表明，计算设计可以通过显著降低治疗开发的成本和资源需求，尤其是在资源有限的地区，为被忽视的热带疾病的疗法开发提供新路径。
主要内容
蛇咬伤中毒在许多发展中地区，尤其是撒哈拉以南非洲、南亚、巴布亚新几内亚和拉丁美洲等资源匮乏地区，构成了严重的公共健康威胁。每年超过两百万例蛇咬伤导致10万人死亡和30万人永久性残疾。2017年，世界卫生组织将蛇咬伤中毒列为优先关注的被忽视的热带疾病之一。然而，用于改善当前抗蛇毒治疗的资源投入仍然非常有限。这些治疗依赖于由高免疫动物血浆制备的多克隆抗体，辅以医疗和手术护理。尽管这些疗法对挽救生命至关重要，但高昂的生产成本和偏远地区冷链基础设施的不足严重限制了抗蛇毒药物的可及性。此外，抗蛇毒药物在使用过程中可能引发严重的不良反应，包括过敏性反应和致热反应。这些治疗在对抗神经毒性和组织坏死方面往往效果不佳，原因是三指毒素（3FTxs）的中和抗体浓度不足。这种低效性源于三指毒素在抗蛇毒生产动物中免疫原性较低，未能引发强抗体反应。此外，由于抗蛇毒治疗的延迟使用，也增加了治疗的挑战性。尽管抗体和非抗体疗法已在临床前研究中得到测试，但这类分子的开发通常需要动物免疫或建立大型分子库，并需进行广泛的筛选、选择和优化。
研究人员认为，从头设计方法相较传统抗蛇毒药物开发方式具有诸多优势。首先，从头蛋白设计不依赖于动物免疫，并可通过重组DNA技术生产蛋白，从而实现连续生产且减少批次间的差异性。其次，计算设计能够生成具有高亲和力和高特异性的结合蛋白，而无需依赖于通常依靠纯毒素的广泛实验筛选程序，这些毒素可能难以从完整蛇毒中分离或通过重组表达获得。第三，设计的小型蛋白相较于大型抗体具有更好的组织渗透性，可以实现快速中和毒素，更有效地防止局部组织损伤。第四，设计的蛋白具有高热稳定性，可通过低成本的微生物发酵策略生产，这将有助于以较低的成本开发和部署新型抗蛇毒疗法。因此，研究人员使用基于深度学习的RFdiffusion方法，针对三指毒素蛇毒毒素家族中的短链和长链α-神经毒素及细胞毒素设计抗蛇毒蛋白。研究人员探索了针对单个天然毒素和代表毒素分子家族的共识毒素的结合蛋白设计，因为后者的结合蛋白可能具有更广泛的中和活性。
α-神经毒素结合蛋白的设计
α-神经毒素是三指毒素（3FTx）中的重要亚类，具有多股β结构，由三个从疏水紧凑核心突出的环和高度保守的二硫键稳定。短链和长链α-神经毒素在长度和二硫键数量上有所不同。尽管它们具有序列同源性，但在不同亚型烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）中的药理特性各异。短链和长链毒素均可抑制肌肉型nAChR，但仅长链毒素能与神经元型α7-nAChR强结合。许多眼镜蛇种的毒性主要来源于这些毒素，因此同时中和两种毒素类型对于实现治疗效果至关重要。
为了实现功能性中和，研究人员专注于通过空间位阻阻断神经毒素与nAChR的结合，而非像此前研究的抗体那样直接靶向nAChR结合位点。通过利用新方法，研究人员设计了能够与极性靶标形成高亲和力结合的结合蛋白。这些方法通过几何匹配的边缘β链设计，与靶标的边缘β链互补。我们使用深度学习的RFdiffusion方法，基于神经毒素的边缘β链结构，生成与毒素形成延展β片层的蛋白主链，然后使用ProteinMPNN进行序列设计。设计通过AlphaFold2和Rosetta指标筛选，最终选择最有潜力的候选蛋白进行实验验证。
针对短链α-神经毒素，研究人员选择了来自眼镜蛇的共识毒素作为代表模板。通过酵母表面展示技术筛选44种设计后，发现一个候选蛋白能以842 nM的解离常数（Kd）结合毒素。经过优化，生成的11种设计中有更高亲和力的蛋白，其中最佳候选SHRT的Kd为0.9 nM。进一步实验表明，SHRT具有单体稳定性、高热稳定性（78°C熔点）以及与计算模型高度一致的晶体结构（分辨率2.58 Å，RMSD为1.04 Å）。SHRT通过与毒素关键环结构的β链和α螺旋区域形成氢键实现结合。
针对长链α-神经毒素，研究人员选择了Naja kaouthia的α-眼镜蛇毒素作为代表。在42种设计中，初步筛选发现一个候选蛋白的Kd为1.3 µM。经过进一步优化，生成38种设计，最佳候选LNG的Kd降至1.9 nM，显示出极高的热稳定性（熔点>95°C）。X射线晶体结构分析显示，LNG与毒素的复合体与设计模型高度一致（分辨率2.68 Å，RMSD分别为0.42 Å和0.61 Å）。LNG通过其β链与毒素β链形成骨架氢键，主要与毒素的中心环II结构相互作用，环II在毒素与肌肉型和神经元型α7-nAChR的结合中至关重要。
这一研究通过深度学习方法设计的蛋白展示了高亲和力、热稳定性和结构精确性，为下一代抗蛇毒疗法提供了新的可能。
细胞毒素结合蛋白的设计
细胞毒素是眼镜蛇毒素中三指毒素（3FTx）家族的一类重要功能组分，通过破坏磷脂膜发挥细胞毒作用，导致局部组织损伤。这些毒素的中和对于防止蛇咬伤患者出现严重后遗症（如肢体畸形、截肢和长期残疾）至关重要。
针对细胞毒素，研究人员认为仅依赖β链配对可能不足以阻止细胞毒素插入膜，因为其三指环在与膜相互作用和破坏中的关键作用。因此，研究人员集中靶向细胞毒素的三指环区域，通过在这些关键区域定义热点残基，利用RFdiffusion方法生成结合蛋白骨架。为增加中和范围，研究人员基于来自86种蛇毒细胞毒素（IA型细胞毒素亚亚家族）的共识序列进行设计。通过ProteinMPNN和AlphaFold2筛选，并结合部分扩散优化，最终选择表现最佳的设计。
研究人员在大肠杆菌中表达了55种设计蛋白，并通过尺寸排阻色谱（SEC）纯化，筛选出18种单体蛋白。在荧光细胞活力实验中，这些蛋白中有一种结合蛋白（CYTX）显示出高溶解性、单一的单体峰以及对Naja pallida和Naja nigricollis整毒（含高细胞毒素含量）具有显著中和活性。SPR实验测得CYTX对N. pallida细胞毒素的解离常数（Kd）为271 nM。CYTX还表现出典型的αβ-蛋白圆二色谱（CD）光谱，热稳定性达到61°C。
由于针对环结构的设计结合蛋白较少，研究人员进一步解析了CYTX与N. pallida细胞毒素复合物的晶体结构。为减少灵活性以促进结晶，设计在CYTX的β片段和两条α螺旋之间引入二硫键，生成热稳定性更高（Tm = 70.3°C）的CYTX_B10，但其对N. pallida细胞毒素的Kd稍弱（740 nM）。CYTX_B10与目标毒素的复合物结构与计算模型高度一致（分辨率2.0 Å；设计RMSD为1.32 Å，毒素RMSD为0.58 Å）。结构显示CYTX_B10与细胞毒素环II和环III之间存在广泛的静电相互作用，包括侧链-主链氢键。这种CYTX_B10的开放结构突显了RFdiffusion在量身定制与靶标形状匹配的蛋白骨架方面的强大能力，以及ProteinMPNN在稳定非传统蛋白结构（如缺乏中央疏水核心的结构）中的优势。
整理 | WJM
参考资料
Vázquez Torres, S., Benard Valle, M., Mackessy, S.P. et al. De novo designed proteins neutralize lethal snake venom toxins. Nature (2025).
https://doi.org/10.1038/s41586-024-08393-x
