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今天为大家介绍的是来自美国圣犹达儿童研究医院Daniel J. Blair团队的一篇论文。从模块化构建块自动合成小分子有机化合物有望彻底改变我们创造药物和材料的能力。该分子构建策略的颠覆性加速广泛释放了其功能潜力,并需要整合许多新的组装化学方法。尽管近期高通量化学的进展可以加快适当合成方法的发展,例如在从大量潜在选项中选择合适的化学反应条件,但同等的高通量分析方法也是必要的。在此,作者报告了一种通过质谱进行化学反应快速定量分析的简化方法。化学构建块的内在碎片化特征使化学反应的分析具有普遍性,允许在不到一秒的时间内读取反应结果。这一进展的核心在于识别出起始物质的碎片化模式作为质谱下游产物分析的通用条形码。结合声波液滴喷射质谱,作者能够消除缓慢的色谱步骤,并在多路复用策略中持续评估化学反应。这使得能够将反应条件分配给源自超高通量化学合成实验的分子。更一般而言,这些结果表明,化学合成固有的碎片化特征可以促进快速且数据丰富的实验。
随着自动化迭代化学合成方法的不断优化,寻找新分子功能的重要目标持续推进(图1a)。尽管小分子有机化合物的自动合成已达到按需获取天然产物、药物和功能材料的复杂水平,但其循环时间的缩短仍不足以高效探索化学空间(图1b)。
图 1
相比之下,许多其他领域通过将模块化平台与高通量分析相结合,显著加快了数据输出和过程优化。然而,对于小分子而言,现有的异步分析过程限制了这一目标的实现。因此,本文提出了一种基于碎片化指纹的通用高通量质谱分析方法(图1c),能够快速、定量地分析化学反应,消除缓慢的色谱步骤,实现多路复用格式下的连续评估,从而大幅提升化学合成的效率和数据丰富性。
中性损失方法
共性是模块化化学合成的基础。因此,作者从研究模块化合成中使用四甲基甲基氨基二乙酸(TIDA)硼酸酯开始寻找碎片化指纹(图2a)。对60种TIDA硼酸酯的碎片化分析显示,58种失去了86道尔顿(Da)的中性碎片(图2b),这一中性损失归因于N–B轴的断裂释放了甲基丙烯酸。在低碰撞能下,硼酸酯的碎片化选择性较高,从而避免了其他的竞争性碎片化。
图 2
为了快速进行反应产物的通用分析,作者采用了中性损失质谱法。在该方法中,串联质谱仪的第一(Q1)和第三(Q3)四极子以预定的固定偏移扫描,当检测到相隔该偏移的信号时收集数据。利用这一方法,常见的中性损失碎片使得不同分子量的样品无需个性化分析配置即可分析。初步实验表明,使用中性损失声波液滴喷射质谱(NL-ADE-MS)时,TIDA硼酸酯失去甲基丙烯酸的中性损失具有高灵敏度和线性响应。此外,该方法在广泛的浓度范围内均表现出良好效果。
相比传统液相色谱-质谱(LC-MS)需要定制分析配置,NL-ADE-MS无需先验信息,仅需样品包含可碎片化的通用成分,适用于高通量合成。该方法还能处理分子量范围广(200 Da)的样品,并将样品分析速度从3秒提升至1.2秒而不降低性能。总体而言,NL-ADE-MS能够在一次分析中处理大量小分子,仅需它们具有共同的碎片化特性。
反应混合物分析
为了测试NL-ADE-MS在审查化学反应结果方面的性能,作者进行了一系列微型化学合成实验(图2a)。使用TIDA硼酸酯构建块1、2、3和4,作者执行了C–N交叉偶联、C–C交叉偶联、C–O键形成、酰胺键形成、还原胺化和烷基化反应。每种反应类别选择了六种合适的偶联伙伴,并设定了64种反应条件,在每种情况下生成了384个化学反应(图2b)。
利用TIDA硼酸酯1–4的碎片化指纹,作者仅用7.68分钟通过NL-ADE-MS确定了每组384个化学反应的相对产物输出,这相当于收集两个LC-MS样品所需的时间。由于作者方法的高准确性,所有64种可能的反应条件下每种反应类型的细粒度特征均能被清晰区分(图2c)。基于这些数据,作者能够准确地确定每种微型化学反应中表现最佳的试剂组合。这些数据按照高通量LC-MS的典型分辨率(±5%)进行了排序。所有情况下与LC-MS数据的紧密相关性表明,NL-ADE-MS对常见化学转化产生的杂质具有广泛的容忍度。
碎片化优先实验
由于碎片化是化学物质的基本特性,NL-ADE-MS方法具有高度的通用性,适用于多种类型的构建块。因此,起始材料的串联质谱分析应直接指导NL-ADE-MS方法的开发,避免对特定产物进行优化(图3a)。
图 3
为了验证这一碎片化优先方法的有效性,作者对多种化学构建块进行了串联质谱分析,包括天然产物(图3b)、叔丁氧羰基(Boc)和四氢吡喃(THP)保护的物质(图3c),以及类药物构建块(图3d)。每一类化合物都失去了独特的可进行分析的碎片。基于起始材料的碎片化指纹,作者能够在384孔板格式中执行广泛的化学转化,并通过NL-ADE-MS直接分析,这一过程在不到8分钟内完成,且准确性与LC-MS相当。值得注意的是,作者的碎片化优先方法通过仅依赖于起始材料的身份,可以将反应分析简化为单一方法和参数设置。
反应条件的多路复用排序
通过在单一样品中混合多种分析物(多路复用),可以提升分析通量。由于NL-ADE-MS基于共同的中性损失碎片直接提取感兴趣的峰,因此只要分析物在质量域中分布,样品多路复用变得简单(图1c)。为了在大规模实验中测试NL-ADE-MS的性能,作者利用96种芳胺构建块(21–116)和8种卤代TIDA硼酸酯构建块(1, 14–20)定义了一个广泛的化学空间区域(图4a)。总共在32个384孔微孔板中进行了12,288次反应,涵盖768种潜在产物和16种不同反应条件(图4b)。
图 4
通过声波液体处理,将所有12,288个反应混合物以8路复用格式加载到单个1,536孔微孔分析板中。NL-ADE-MS以每样品1.2秒的速度,仅用32分钟便收集了所有反应结果数据,相比之下,传统LC-MS在相同样品数量下需要连续操作25.6天。为快速处理多路复用的NL-ADE-MS数据,作者开发了一个软件包,能够直接且准确地将数据分配到其对应的孔位。
高通量实验的主要目标之一是提取关键特征以指导化学空间的探索。作为案例研究,作者设定了三种高内容度实验活动的目标:1)多样化单一化学骨架的发现化学方法(情景1和2),2)在广泛化学空间中寻找特定反应的最高产出条件,即通用条件(情景3)。
情景1:特定卤素的反应条件
对所有96种胺(21–116)中卤代TIDA硼酸酯1的分析准确地优先选择了XantPhos Pd G4和DBU作为最佳反应条件,与LC-MS数据的排序效率高度一致(图4b),并且对TIDA硼酸酯14、15和16的特征提取同样有效。
情景2:特定胺的反应条件
分析胺68与所有八种TIDA硼酸酯(1, 14–20)的反应显示出优异的性能,并选择了tBuXPhos Pd G4和DBU作为最佳反应条件(图4c)。对24种胺(45–68)的数据分析显示出良好的相关性,并且在三分之一的情况下能够直接识别最佳条件。
情景3:通用性验证
通过评估大量反应条件,可以通过识别通用条件来最大化合成方法的总产出。将NL-ADE-MS数据与LC-MS的50%子集进行直接比较,结果显示出一致的行为,优先排序了384种潜在反应产物的条件(图4d)。在所有情况下,NL-ADE-MS数据与LC-MS数据的排序方式几乎完全一致,正确识别出tBuXPhos Pd G4和MTBD作为最佳条件。
结论
作者的数据验证了共同中性损失碎片在广泛背景下实现快速化学反应读数的通用性。采用碎片化优先的方法设计高通量实验将加速新功能的发现,但广泛应用的一个重要考虑因素是识别驱动或阻碍分析的弱化学键。快速定量读数的探索性研究、原生条件下的反应动力学、通过中性损失LC-MS/MS排序反应条件以及起始材料命运的探讨展示了碎片化优先思维的未来潜力。
参考资料
Hu M, Yang L, Twarog N, et al. Continuous collective analysis of chemical reactions[J]. Nature, 2024, 636(8042): 374-379.