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近日，来自德国维尔茨堡大学（University of Wuerzburg）的丁美琪等研究人员在Nature杂志在线发表了题为Probing plant signal processing optogenetically by two channelrhodopsins的研究论文，利用光遗传学工具解码了植物电信号和钙信号背后所编码的植物胁迫应答。
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面对外界的刺激，具有固着生长特性的植物会快速的响应并伴随著代谢产物水平的变化与基因表达调控的改编。电信号，Ca2+信号与ROS 信号是应对不同的外界胁迫刺激（包括受伤，病原菌侵害，干旱胁迫，盐胁迫等）中最早发现的植物响应因子 (Verma et al., 2016; Bharath et al., 2021; Fichman et al., 2023)。而在植物胁迫响应中电信号，Ca2+信号ROS 信号与植物激素信号相互作用形成复杂的调控网络机制(Gilroy et al., 2016; Kollist et al., 2019)。然而这些特异的信号因子如何编码植物生理响应的分子机理目前还缺少深入的研究。由维尔茨堡大学神经生理研究所的光遗传学实验室和植物生理研究所联合主导完成并发表在Nature上的最新成果为这一问题提供了新颖的研究思路。他们运用了精密的光遗传学工具诱导了不同性质的电信号和Ca2+信号并探索了这些特异信号所编码的生理响应。
精密的光遗传学工具提供有效的研究方法
在研究植物胁迫响应中如何从复杂的调控信号网络中区分特定的信号因子是一个艰难的课题。这一研究中应用了光遗传学工具来编码不同的信号因子。基于视紫红质通道蛋白的光遗传学技术可以通过光对细胞进行非侵入性的精准操作，此类调控具有高度可逆性和时空精准性（时间上实现毫秒级别的操控，空间上实现亚细胞水平操控），可以根据科研工作者的需求编码预期设计得特定信号。
十几年前，Science 杂志将光遗传学评为“十年内的重大突破技术”。该技术使利用光脉冲控制细胞的电生理活动成为可能。光遗传学是利用基因工程将“光受体蛋白”导入特定细胞或生物后，通过光对它们进行操控。目前光遗传学已经是神经生物学研究的热门技术。其中Georg Nagel和Peter Hegemann在2003年发表的光控阳离子通道Channelrhodopsin是在光遗传学技术中应用最广泛的光受体工具类型。
基于植物的生长条件和细胞化学组分限制，光遗传学技术在植物生物学中的研究要大大滞后。在2018年，高世强主持设计了一个包含8个元件的新型融合工具，基于此工具，周杨和丁美琪主导并顺利开展了一系列植物光遗传学研究，并于2021年发表在Nature Plants上。此研究首次报导了在植物中引入产生视黄醛的蛋白酶以促进channelrhodopsin在植物细胞中的上膜表达。这一技术突破极大的促进了植物光遗传学的发展，也为目前发表在Nature的研究打下了坚实基础（点击查看：Nature Plants | 技术突破！光遗传学工具应用于植物，调节植物生长）。
高世强博士与杨尚博士基于此前发表的ChR2-XXM (Nagel et al., 2003; Duan et al., 2019) 进行了进一步分子改造及末端修饰，从众多突变体中筛选出具有高Ca2+通透性的XXM 2.0。绿光激活XXM 2.0后使得Ca2+向细胞质中内流并伴随着质膜去极化。长久以来Ca2+信号在植物中的研究大多基于Ca2+信号元件或Ca2+通道的功能缺失方法进行探索，而该研究通过功能获得性表达一个具有开/关特征的光控通道来调控植物[Ca2+]cyt水平。与此同时ACR1 2.0 (Zhou et al., 2021) 也被应用到这一研究中，相同的绿光激活后诱导阴离子外流并伴随着质膜去极化。该研究运用全光学生理测量技术来激活并监测两种视紫红质蛋白诱导的质膜电位的变化和Ca2+信号。ACR1 2.0 和XXM 2.0均可引起相当的质膜去极化。与ACR1 2.0相比XXM 2.0则可以诱导[Ca2+]cyt升高。两个视紫红质蛋白的使用可以有效的比较[Ca2+]cyt信号，电信号以及阴离子外流所编码的植物生理响应。
光遗传学诱导不同的植物胁迫响应
ACR1 2.0 与XXM 2.0 在蓝光或绿光下可以被激活，而表达这两个视紫红质通道蛋白的烟草可以在红光下完成正常的生长周期。丁美琪博士在研究中发现额外加上弱绿光处理后，表达两个蛋白的烟草表现出了截然不同的表型现象: ACR1 2.0的激活导致了叶片的萎蔫而XXM 2.0 则诱导叶片坏死。这些表型表明ACR1 2.0 和XXM 2.0分别诱导渗透胁迫和免疫应答相关的信号通路。XXM 2.0激活后，H2O2的累积滞后于[Ca2+]cyt信号和电信号的产生。相比之下，ACR1 2.0引起了类似的质膜去极化，但没有观察到明显的ROS积累。这一结果支持了植物中依赖Ca2+的H2O2产出。代谢产物分析与转录组分析进一步比较了两种生理响应。绿光处理后，ACR1 2.0植物中引起了渗透压胁迫相关的代谢产物ABA与脯氨酸的累积以及相关信号通路的激活。而关闭绿光后，ACR1 2.0植物叶片膨胀压会快速的恢复，同时激素与基因表达也恢复到基准水平。与此同时，XXM 2.0 的激活则调节了免疫响应相关代谢通路以及相关基因的表达， JA 和 SA 表现出不同的浓度水平动力学变化，在胁迫响应中表现出拮抗关系。
该研究揭示了一个长时间的电压变化可能不能转化为特异性的渗透压或免疫生理响应。这些结果支持了一个观点: ACR1 2.0介导的渗透压胁迫响应源于阴离子通过激活的ACR1 2.0外流并伴随着质膜去极化使得电压门控的K+通道打开，从而引起K+离子外流 (Huang et al., 2021)。另一方面，XXM 2.0调控Ca2+流入细胞质从而引起免疫响应表明[Ca2+]cyt在这一生理响应中为关键的信号因子。
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图注: 绿光激活ACR1 2.0并形成阴离子细胞外流，诱导植物干旱胁迫响应伴随著ABA的累积与ABA等信号通路的激活。XXM 2.0 激活形成的Ca2+ 细胞内流诱导植物免疫响应，表现出SA等相关激素的水平的提高与细胞程序性死亡。（图片来源：丁美琪/维尔茨堡大学）光控ACR1 2.0 诱导渗透压胁迫响应的快速可逆性的特征也为大家提供了精准研究恢复机制的手段。对未来培育抗旱抗盐的植物筛选具有重要意义。同时进行的膜电位监测和[Ca2+]cyt信号监测显示，光诱导的XXM 2.0介导的[Ca2+]cyt信号伴随着可重复的质膜电位变化，两者都可以通过光强度或光照时间进行调控。这为进一步研究Ca2+信号调节植物免疫响应提供极其有效的研究手法。也为探索局部与系统信号编码与传播的研究创造更丰富的可能。在培育新型高产抗病农作物和利用光处理诱导植物抗性方面具有很高的潜在应用价值。据悉，维尔茨堡大学植物生理研究所的Kai Konrad，神经生理研究所光遗传实验室负责人高世强，Georg Nagel，和植物生理研究所的丁美琪共同设计了该研究课题。该研究的具体实验工作主要由丁美琪主导开展。尤其是在长达两年的审稿过程中，丁美琪设计了一系列新实验完美解答了审稿人的多个问题。原神经生理研究所光遗传实验室的的周杨（现就职于郑州大学生命科学学院）和杨尚（现就职于美国霍华德休斯医学研究所）以及植物生理研究所Dirk Becker教授为该研究做出的重要贡献，并列为共同第一作者。维尔茨堡大学植物生理所，药物所，神经生理所的研究者一起参与了该项目的完成。该课题的资助来自于Georg Nagel，高世强，Kai Konrad和Rainer Hedrich所主持的多个德国科学基金会（DFG）基金项目，丁美琪和周杨在博士就读阶段获得了中国国家公派留学基金委(CSC)的大力支持。植物光遗传学技术作为植物生理学尤其是植物电生理学研究的新兴方向，具有广阔的应用场景，对这一领域的进一步细致了解可参考近期高世强博士实验室组织发表的两篇综述文章。Advances and prospects of rhodopsin-based optogenetics in plant research. Plant Physiology, 2021. 以及Optogenetic Methods in Plant Biology. Annual Review of Plant Biology, 2023。1. Bharath, P., Gahir, S., and Raghavendra, A.S. (2021). Abscisic Acid-Induced Stomatal Closure: An Important Component of Plant Defense Against Abiotic and Biotic Stress. Frontiers in Plant Science 12.2. Duan, X.D., Nagel, G., and Gao, S.Q. (2019). Mutated Channelrhodopsins with Increased Sodium and Calcium Permeability. Appl Sci-Basel 9.3. Fichman, Y., Xiong, H., Sengupta, S., Morrow, J., Loog, H., Azad, R.K., Hibberd, J.M., Liscum, E., and Mittler, R. (2023). Phytochrome B regulates reactive oxygen signaling during abiotic and biotic stress in plants. New Phytologist 237, 1711-1727.4. Gilroy, S., Białasek, M., Suzuki, N., Górecka, M., Devireddy, A.R., Karpiński, S., and Mittler, R. (2016). ROS, Calcium, and Electric Signals: Key Mediators of Rapid Systemic Signaling in Plants. Plant Physiology 171, 1606-1615.5. Huang, S., Ding, M., Roelfsema, M.R.G., Dreyer, I., Scherzer, S., Al-Rasheid, K.A.S., Gao, S., Nagel, G., Hedrich, R., and Konrad, K.R. (2021). Optogenetic control of the guard cell membrane potential and stomatal movement by the light-gated anion channel GtACR1. Science advances 7.6. Kollist, H., Zandalinas, S.I., Sengupta, S., Nuhkat, M., Kangasjärvi, J., and Mittler, R. (2019). Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network. Trends in Plant Science 24, 25-37.7. Nagel, G., Szellas, T., Huhn, W., Kateriya, S., Adeishvili, N., Berthold, P., Ollig, D., Hegemann, P., and Bamberg, E. (2003). Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 13940-13945.8. Verma, V., Ravindran, P., and Kumar, P.P. (2016). Plant hormone-mediated regulation of stress responses. BMC plant biol. 16, 86.9. Zhou, Y., Ding, M., Gao, S., Yu-Strzelczyk, J., Krischke, M., Duan, X., Leide, J., Riederer, M., Mueller, M.J., Hedrich, R., Konrad, K.R., and Nagel, G. (2021). Optogenetic control of plant growth by a microbial rhodopsin. Nature plants 7, 144-151.https://www.nature.com/articles/s41586-024-07884-1
