Chip-Seq分析（3）比对到参考基因组

ChIP-seq的比对使用 bowtie2

构建基因组 index

常见物种的 index 可以直接从 bowtie2 官网下载。

# 通过基因组构建index
bowtie2-build --threads 1 genome.fa   genome  1>logs/bowtie2_build.log 2>&1

• bowtie2-build：这是 Bowtie 2 中的一个命令，用于构建基因组索引。
• --threads 1：指定使用的线程数量。
• genome.fa：这是输入的基因组序列文件，通常是一个FASTA格式的文件。
• genome：这是输出索引文件的前缀。Bowtie 2 将生成一组以 genome 开头的索引文件。
• 1>logs/bowtie2_build.log：将标准输出（通常是运行过程中的信息）重定向到 logs/bowtie2_build.log 文件中。
• 2>&1：将标准错误输出（通常是错误信息）重定向到与标准输出相同的文件中。

比对

# 单端数据
bowtie2 -p 1 \
  -x genome \
  -U A_R1.fastq.gz \
  -S A.sam \
  1>A_bowtie2_align.log 2>&1

#双端数据
bowtie2 -p 1 \
  -x genome \
  -1 A_R1.fastq.gz \
  -2 A_R2.fastq.gz \
  -S A.sam 
  1>A_bowtie2_align.log 2>&1

• bowtie2：这是 Bowtie 2 中的一个命令，用于进行序列比对。
• -p 1：指定使用的线程数量。在这里，设置为 1，表示只使用一个线程进行比对。
• -x genome：指定参考基因组的索引前缀，这里是 genome，它对应于之前由 bowtie2-build 命令生成的索引文件。
• -U A_R1.fastq.gz：指定输入的单端测序读长文件，这里是 A_R1.fastq.gz。
• -1 A_R1.fastq.gz：指定输入的前向读长文件，这里是 A_R1.fastq.gz。
• -2 A_R2.fastq.gz：指定输入的反向读长文件，这里是 A_R2.fastq.gz。
• -S A.sam：指定输出的比对结果文件，这里是 A.sam，采用SAM格式。
• 1>A_bowtie2_align.log：将标准输出（通常是运行过程中的信息）重定向到 A_bowtie2_align.log 文件中。
• 2>&1：将标准错误输出（通常是错误信息）重定向到与标准输出相同的文件中。

排序并转换为 bam

samtools sort \
  -@ 1 \
  -o A_sorted.bam \
  A.sam \
  1>Asort_bam.log \
  2>&1

samtools index A_sorted.bam

参数解释

• samtools sort：这是 samtools 工具中的排序命令，用于将 SAM/BAM 文件按位置排序。
• -@ 1：指定使用的线程数量。在这里，设置为 1，表示只使用一个线程进行排序。
• -o A_sorted.bam：指定输出文件名，这里是 A_sorted.bam，即排序后的 BAM 文件。
• A.sam：这是输入的未排序的 SAM 文件。
• samtools index：这是 samtools 工具中的索引命令，用于为 BAM 文件建立索引。
• A_sorted.bam：这是输入的已排序的 BAM 文件。

过滤及其他处理

通常的做法是使用 picard 标记 duplicates，然后使用 samtools 去除各种低质量比对。deeptools 包中的 alignmentSieve 能够一步完成这些操作。

这一步过滤

duplicates : 经过比较与 Picard 结果差异很小

低质量比对：MAPQ 小于 20 或 30

未比对上的 reads：SAM flag 4

supplementary alignment：SAM flag 2048

比对到黑名单区域的 reads：黑名单、线粒体、叶绿体、大肠杆菌等

alignmentSieve \
  --numberOfProcessors 1 \
  --bam A_sorted.bam \
  --outFile A_final.bam \
  --filterMetrics A1_sieve_alignment.log \
  --ignoreDuplicates \
  --minMappingQuality 25 \
  --samFlagExclude 260 \
  --blackListFileName ref/blacklist.bed \
  1>logs/A_sieve_alignment.log 2>&1
        
samtools index A_final.bam

• alignmentSieve：这是一个用于过滤和处理 BAM 文件的工具。

• --numberOfProcessors 1：指定使用的处理器数量。在这里，设置为 1，表示只使用一个处理器。

• --bam A_sorted.bam：指定输入的 BAM 文件，这里是 A_sorted.bam。

• --outFile A_final.bam：指定输出的 BAM 文件，这里是 A_final.bam。

• --filterMetrics A1_sieve_alignment.log：将过滤统计信息输出到 A1_sieve_alignment.log 文件中。

• --ignoreDuplicates：忽略 PCR 或光学重复的读长。

• --minMappingQuality 25：过滤掉比对质量低于 25 的读长。

• --samFlagExclude 260：排除 SAM 标志为 260 的读长。这意味着排除多次比对和未比对的读长。

• --blackListFileName ref/blacklist.bed：指定一个黑名单文件，这里是 ref/blacklist.bed，用于过滤掉在这些区域中的读长。

• samtools index：这是 samtools 工具中的索引命令，用于为 BAM 文件建立索引。

• A_final.bam：这是输入的已处理的 BAM 文件。

每个步骤中过滤掉了多少 reads 可以使用 deeptools 中的 estimateReadFiltering 进行统计。

过滤后的数据就可以进行后续分析了。