言归正传~帕金森病 (Parkinson’s disease, PD) 是继阿尔茨海默病之后第二大最常见的退行性疾病,常发生于中老年群体。PD 是多个基因和环境因素相互作用的结果,发病机制复杂。主要包括:氧化应激、线粒体功能障碍、α-突触核蛋白失衡、神经炎症、肠道微生物紊乱 (图 1)。
神经毒素包括 6-OHDA、MPTP 和鱼藤酮 (Rotenone)、百草枯 (Paraquat) 等。急性接触神经毒素会通过破坏线粒体功能和/或增加氧化应激而导致运动障碍和黑质纹状体多巴胺能细胞快速死亡,而长期服用神经毒素会诱发进行性模型,其中可能包括诱导 α-突触核蛋白聚集体生成 (图 3)。
MPTP:穿过血脑屏障,在神经胶质细胞中被 MAO-B 代谢为 MPP+,然后代谢为活性毒性化合物。MPP+ 随后被多巴胺转运蛋白吸收,通过抑制电子传递链的复合物 I 来损害线粒体呼吸,从而引起氧化应激和程序性细胞死亡分子途径的激活。
Paraquat 和 6-OHDA 容易通过多巴胺转运蛋白穿过细胞膜,也可能通过靶向线粒体发挥毒性,随后产生 ROS 和醌,导致黑质纹状体多巴胺能神经元退化。 Rotenone 具有极强的疏水性,容易穿透细胞膜,诱导 α‐突触核蛋白聚集体的形成和线粒体损伤,随后产生 ROS 和醌。
下面是小 M 为大家整理的 PD 神经毒素模型的方法、特点和应用,大家可以点赞收藏喔~
表 1. 神经毒素模型的方法、特点和应用[4][5][6][7][8]。
当然,在进行 MPTP 的造模时,也要注意鼠的选择,注射方式,给药方案等,提高造模成功率!
黑质纹状体损伤: 造模成功后黑质和纹状体区域 TH 减少 (IHC, IF, WB 等方法都可以);
大脑神经递质 DA, DOPAC, 5-HT, HVA 等减少 (可通过 HPLC 检测);
黑质纹状体小胶质细胞 (IBA1+ cells) 和星形胶质细胞 (GFAP+ cells) 激活, 黑质区 α-syn 聚集体数量增加。
▐ Open Field Test 旷场试验
500×500×300 mm 旷场,旷场底面被平均分为 16 个 4×4 个小方格。正上方架摄像头,视野覆盖整个旷场。将动物放置在正中央格,同时进行摄像和计时,时间为 5 min。
通过计算机示踪分析系统分析实验动物的水平活动 (中央格停留时间、穿过中央格的次数、梳毛次数) 和直立次数,能够反映动物的焦虑情况。
▐ Rotarod test 转棒试验
▐ Pole test 爬杆测试
将一根 1 cm 粗、50 cm 长的木棒固定在实验台之上,用纱布绕棒包裹以防止小鼠攀爬滑动。将木棒竖直放置,将小鼠放置于木棒下方,计算小鼠到木棒上方并折返回到杆的底部的时间。每只小鼠完成 3 次,两次实验之间的间隔在 10 min 以上,取三次的平均时间作为最后结果。
▐ 酪氨酸羟化酶 (TH)
帕金森病典型的病理学特征为 α-synuclein 在中脑黑质-纹状体区的异常聚集,造成多巴胺能神经元死亡。
实验方案:
20 mg/kg 或 23.4 mg/kg,腹腔注射,每隔 2 h 注射一次,一天内打 4 次。12 周雄性 C57BL/6N 小鼠。给药完 7 天后取材 (有文献表明急性给药后第7天黑质纹状体损伤达到稳定)[5]。
纹状体 TH 平均清除率:60% (20 mg/kg),79% (23.4 mg/kg);
黑质致密部 (SNpc) TH 平均清除率:43% (20 mg/kg),47% (23.4 mg/kg)。
2. 造模后可能会死亡:一个常见问题是动物在开始给药后的前 24 小时内急性死亡,雌性小鼠的死亡率较高。值得注意的是,急性死亡与大脑多巴胺能系统的损伤无关,有可能是由于外周心血管副作用。药物剂量高/小鼠体重小于 22 g/不同批次药物混用/小鼠没有提前适应/动物房太冷均有可能会导致小鼠死亡,每组动物数目建议增大。
3. 注射后,肉眼可以注意观察小鼠是否有活动性减弱、走路踉跄,抽搐、炸毛,排尿变多等表现,这种行为可能可以持续 24-48 h,此后小鼠表现基本正常。
[1] Jankovic J, et al. Parkinson's disease: etiopathogenesis and treatment. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2020 Aug;91(8):795-808.
[2] Jackson-Lewis V, et al. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat Protoc. 2007;2(1):141-51.
[3] Javier Blesa, et al. Animal Models of Parkinson’s Disease. Challenges in Parkinson's Disease. 2016.
[4] Konnova EA, et al. Animal Models of Parkinson’s Disease. In: Stoker TB, Greenland JC, editors. Parkinson’s Disease: Pathogenesis and Clinical Aspects [Internet]. Brisbane (AU): Codon Publications; 2018 Dec 21. Chapter 5.
[5] Rabaneda-Lombarte N, et al. The CD200R1 microglial inhibitory receptor as a therapeutic target in the MPTP model of Parkinson's disease. J Neuroinflammation. 2021 Apr 6;18(1):88.
[6] Lee, et al. MPTP-driven NLRP3 inflammasome activation in microglia plays a central role in dopaminergic neurodegeneration. Cell Death Differ. 2019 Jan;26(2):213-22.
[7] Chen HX, et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson's disease model by inducing autophagy. Cell Death Dis. 2020 Apr 27;11(4):288.
[8] Ma XZ, et al. Gut microbiota-induced CXCL1 elevation triggers early neuroinflammation in the substantia nigra of Parkinsonian mice. Acta Pharmacol Sin. 2024 Jan;45(1):52-65.
[9] Rabaneda-Lombarte N, et al. The CD200R1 microglial inhibitory receptor as a therapeutic target in the MPTP model of Parkinson's disease. J Neuroinflammation. 2021 Apr 6;18(1):88.
[10] Sun MF, et al. Neuroprotective effects of fecal microbiota transplantation on MPTP-induced Parkinson's disease mice: Gut microbiota, glial reaction and TLR4/TNF-α signaling pathway. Brain Behav Immun. 2018 May;70:48-60.
[11] Kuniishi H, et al. Early deprivation increases high-leaning behavior, a novelanxiety-like behavior, in the open field test in rats. Neurosci Res. 2017 Oct;123:27-35.
[12] Pritchett D, et al. Searching for cognitive enhancement in the Morris water maze: better and worse performance in D-amino acid oxidase knockout (Dao(-/-)) mice. Eur J Neurosci. 2016 Apr;43(7):979-89.
[13] Lu Y, et al. Metabolic Disturbances in the Striatum and Substantia Nigra in the Onset and Progression of MPTP-Induced Parkinsonism Model. Front Neurosci. 2018 Feb 20;12:90.
[14] Calabresi P, et al. Alpha-synuclein in Parkinson's disease and other synucleinopathies: from overt neurodegeneration back to early synaptic dysfunction. Cell Death Dis. 2023 Mar 1;14(3):176.