RNA甲基化修饰整体研究方案

m5C项目案例：RCMS编辑系统在特定细胞RNA位点的靶向m5C甲基化和去甲基化研究

本研究作者开发了一种基于CRISPR-Cas13d的编辑系统，名为重编程m5C修饰系统（RCMS），用于特定转录本中的靶向m5C甲基化和去甲基化。通过m5C RNA-BS等分析揭示RCMS编辑系统能够精确地在特定RNA位点添加或去除m5C修饰，改变细胞转录本稳定性。

图：RCMS dCasRx-NSUN6 编辑器的特异性和非靶甲基化测序[1]

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m6A项目案例：猪骨骼肌发育和生长过程中协调的转录和转录后表观遗传调控

对长白猪在出生后四个生长期（30天、60天、120天和180天）的骨骼肌样本进行全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）和甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq），揭示了5mC和m6A修饰在表观基因组和表观转录组范围内的相关动态和共生，这是猪出生后肌生成进程中5mC/m6A串扰的结果；并鉴定一组在猪出生后骨骼肌生长中由5mC和m6A修饰共同调控的肌生成相关基因。

图：MeRIP-seq揭示出生后骨骼肌发育中的m6A表观转录组动态变化[2]

m5C案例：NSUN2介导的m5C RNA甲基化在视网膜母细胞瘤进展中的重要作用

本研究通过视网膜母细胞瘤（RB）细胞和临床样品中的mRNA分离和抗m5C dot blot试验检测全局和mRNA m5C水平。建立原位眼内异种移植模型以检查RB的致癌行为，病进行全基因组多组学分析以鉴定NSUN2的功能靶标，包括蛋白质组学分析，转录组筛选和m5C甲基化RNA免疫沉淀测序（m5C meRIP-seq）。研究结果表明，NSUN2介导的m5C RNA甲基化在RB的致癌过程中促进嘌呤的生物合成。

图：m5C MeRIP-seq鉴定NSUN2的潜在RNA靶标[3]

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m7G案例：mRNA上m7G修饰的识别蛋白IGF2BP3可促进mRNA降解

本研究识别出IGF2BP蛋白家族，尤其是IGF2BP3，可以优先结合癌细胞中 mRNA上的内部m7G。这一特异性结合，通过IGF2BP3与外泌体复合物的EXOSC2相互作用，可以促进 m7G 修饰的转录本的降解。研究团队进一步利用无催化活性的 dCas13b系统分别与IGF2BP3和METTL1偶合，对转录本上特定位点m7G修饰进行调控，从而改变转录本的稳定性。

图：MeRIP-seq揭示TP53转录本上存在m7G修饰，受METTL1调控[4]

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m1A案例：真核生物mRNA中的m1A甲基化动态变化研究

本研究对人HeLa（宫颈腺癌），HepG2（肝细胞癌）和HEK293（胚胎肾）细胞系（ATCC）和原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）（C57BL / 6，ATCC）进行基于抗体富集的RNA甲基化免疫沉淀测序（MeRIP-seq），在转录组范围定位m1A位点，并将其与Dimroth重排反应进行耦联以获得高分辨率m1A图谱。结果表明m1A在第一个剪接位点上游起始密码子周围富集，m1A倾向于修饰翻译起始位点周围一些更结构化的区域，可以对生理条件做出动态响应，并与蛋白质生成呈正相关。

图：m1A MeRIP-seq表明m1A与人转录组中的翻译起始位点（TIS）相关[5]

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acRIP-seq案例：mRNA中胞嘧啶核苷乙酰化可提高翻译效率

本研究通过对WT和下调NAT10的Hela细胞进行acRIP-seq和mRNA-seq，揭示了ac4C在编码序列中的特异性乙酰化区域富集。NAT10敲除导致在比对mRNA位点的ac4C检测减少，并与靶向mRNA整体下调相关。对mRNA半衰期分析显示，乙酰化mRNA稳定性依赖于NAT10。进一步实验表明，mRNA乙酰化在体内外增强底物翻译。在ac4Cpeaks的密码子含量分析揭示了在动态位点中胞嘧啶的偏倚表达，从而影响mRNA解码效率。

图：acRIP-seq绘制mRNA ac4C图谱[6]

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RIP-seq案例：SRSF6调控可变剪切促进肿瘤进展，为结直肠癌（CRC）治疗提供靶点

本研究通过RIP-seq鉴定SRSF6调控的可变剪切（AS）及其结合位点，揭示SRSF6在CRC样本中上调，并与不良预后相关，在体外和体内促进增殖和转移。鉴定出SRSF6调控的AS靶标，并揭示SRSF6结合位点。SRSF6通过直接结合到其23号外显子位点来调控ZO-1异常剪接，从而作为癌基因发挥作用。

图：RIP-seq鉴定SRSF6调控的RNA结合motif[7]

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① Zhang T,et al. Programmable RNA 5-methylcytosine (m5C) modification of cellular RNAs by dCasRx conjugated methyltransferase and demethylase. Nucleic Acids Res. 2024 Feb 15. pii: 7608824. doi: 10.1093/nar/gkae110. PubMed PMID: 38366553.

② Zhang D, et al. Coordinated transcriptional and post-transcriptional epigenetic regulation during skeletal muscle development and growth in pigs. J Anim Sci Biotechnol. 2022 Dec 1;13(1):146. pii: 10.1186/s40104-022-00791-3. doi: 10.1186/s40104-022-00791-3. PubMed PMID: 36457054.

③ Zuo S, et al. NSUN2-mediated m5 C RNA methylation dictates retinoblastoma progression through promoting PFAS mRNA stability and expression. Clin Transl Med. 2023 May;13(5):e1273. doi: 10.1002/ctm2.1273. PubMed PMID: 37228185.

④ Liu C, Dou X, Zhao Y, Zhang L, Zhang L, Dai Q, Liu J, Wu T, Xiao Y, He C. IGF2BP3 promotes mRNA degradation through internal m7G modification. Nat Commun. 2024 Aug 28;15(1):7421. pii: 10.1038/s41467-024-51634-w. doi: 10.1038/s41467-024-51634-w. PubMed PMID: 39198433.

⑤ Dominissini D, et al. The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 2016 Feb 25;530(7591):441-6. pii: nature16998.

⑥ Arango D, et al. Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency. Cell. 2018 Dec 13;175(7):1872-1886.e24. pii: S0092-8674(18)31383-7. doi: 10.1016/j.cell.2018.10.030. PubMed PMID: 30449621.

⑦ Wan L, et al. SRSF6-regulated alternative splicing that promotes tumour progression offers a therapy target for colorectal cancer. Gut. 2019 Jan;68(1):118-129. pii: gutjnl-2017-314983. doi: 10.1136/gutjnl-2017-314983. PubMed PMID: 29114070.

m5C是RNA百余种修饰中研究较多的一种。m5C存在于tRNA上时，可以对翻译进行调节；存在于rRNA上时，可以对核糖体的生物合成进行质控；存在于mRNA上时，则可以影响mRNA的结构、稳定性及翻译过程。

1、常规mRNA m5C甲基化测序（RNA-BS）：

mRNA分离后首先通过亚硫酸盐处理，非甲基化的C转变为U，m5C修饰的碱基保持不变，结合高通量测序，可以对RNA上的每一个C碱基修饰进行定位与定量。

2、常规mRNA +lncRNA m5C甲基化测序（全转录组RNA-BS）：

易基因科技建立的升级版m5C RNA甲基化测序服务，去除人rRNA后，剩余RNA经重亚硫酸盐处理后，结合高通量NGS策略，可在全转录组范围内单碱基分辨率地检测基因m5C甲基化修饰分布。

技术优势：

研究方向：

易基因MeRIP-seq技术利用m⁶A特异性抗体富集发生m⁶A修饰的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），结合高通量测序，可以对RNA上的m⁶A修饰进行定位与定量，总RNA起始量可降低至10μg，最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症发生与发展、药物应答等研究领域；可应用于动物、植物、细胞及组织的m⁶A检测。

大样本量m⁶A-QTL性状关联分析，传统MeRIP单个样品价格高，通常难以承担。易基因开发建立MeRIP-seq2技术，显著提成IP平行性，实现不同样本间相对定量，降低检测成本。

易基因提供适用于不同科研需求的MeRIP技术：

• m⁶A甲基化-常量mRNA 甲基化测序（MeRIP-seq）

• m⁶A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化测序（lnc-MeRIP-seq）

• m⁶A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化测序（Micro-lnc-MeRIP-seq）

• 高通量m⁶A甲基化-常量mRNA甲基化测序（MeRIP-seq2）

技术优势：

• 起始量低：样本起始量可降低至10-20μg，最低仅需1μg总RNA；
  

• 转录组范围内：可以同时检测mRNA和lncRNA；

• 样本要求：可用于动物、植物、细胞及组织的m⁶A检测；

• 重复性高：IP富集重复性高，最大化降低抗体富集偏差；

• 应用范围广：广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症的发生与发展、药物应答等研究领域。

研究方向：

m⁶A甲基化目前主要运用在分子机制的理论性研究

• 疾病发生发展：肿瘤、代谢疾病（如肥胖/糖尿病）、神经和精神疾病（如阿尔兹海默症/抑郁症）、炎症…

• 发育和分化：早期胚胎发育、个体/组织/器官生长发育、干细胞分化与命运决定、衰老

• 环境暴露与响应：污染、抗逆、生活方式

关于m⁶A甲基化研究思路：

（1）整体把握m⁶A甲基化图谱特征：m⁶A peak数量变化、m⁶A修饰基因数量变化、单个基因m⁶A peak数量分析、m⁶A peak在基因元件上的分布、m⁶A peak的motif分析、m⁶A peak修饰基因的功能分析

（2）筛选具体差异m⁶A peak和基因：差异m⁶A peak鉴定、非时序数据的分析策略、时序数据的分析策略、差异m⁶A修饰基因的功能分析、差异m⁶A修饰基因的PPI分析、候选基因的m⁶A修饰可视化展示

（3）m⁶A甲基化组学&转录组学关联分析：Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、m⁶A修饰目标基因的筛选策略

（4）进一步验证或后期试验

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