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图1. 渗透胁迫下BIK1与SnRK2.6互作
研究人员首先分析了BIK1对PP2C-SnRK2复合体的影响。通过酵母三杂交实验（Y3H）（图2A）、荧光素酶互补实验（LCI）（图 2B）以及体外磷酸化实验（图2C），发现BIK1参与介导SnRK2的解抑制。渗透处理后，BIK1在酵母体系中阻止了ABI1蛋白磷酸酶和SnRK2.6的结合，且该过程依赖于BIK1的酶活。在烟草瞬时表达体系中，BIK1抑制了SnRK2.6和ABI1、HAB1等蛋白磷酸酶的互作，且该过程依赖于BIK1的酶活。在体外磷酸化实验中，PP2CA蛋白磷酸酶抑制SnRK2.6激酶活性；在BIK1存在的情况下，SnRK2.6的磷酸化逐步恢复，表明BIK1可以磷酸化修饰SnRK2.6-PP2CA复合体成员，或者通过结合释放SnRK2.6。
图2. BIK1解除PP2C对SnRK2.6的抑制
渗透介导的SnRK2释放不依赖于ABA受体PYL。ABA信号对SnRK2的释放依赖于PYL与ABI1的第180位的甘氨酸的结合。ABI1-G180D的突变阻止了PYL和ABI1的结合，从而阻断ABA介导的SnRK2释放和激活。然而，ABI1-G180D的突变不影响渗透介导的SnRK2的释放和激活（图 3A），且BIK1可以解除ABI1-G180D对SnRK2.6的抑制。这些结果表明，渗透和ABA信号介导的SnRK2.6的释放，通过影响SnRK2.6-ABI1结合的不同界面实现（图 3B）。
图3. 渗透和ABA信号介导的SnRK2.6的释放机制不同
鉴于BIK1对SnRK2.6的释放依赖于BIK1酶活，研究人员分析了BIK1对SnRK2.6和ABI1的磷酸化修饰。BIK1具有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸（Tyr，Y）激酶活性，可以磷酸化修饰SnRK2.6，但不能磷酸化ABI1。通过质谱鉴定到BIK1可能磷酸化SnRK2.6的13个位点，包括多个SnRK2自磷酸位点，以及Y163和Y182两个酪氨酸残基。利用特异识别酪氨酸磷酸化的抗体，验证了BIK1可以对SnRK2.6的Y163和Y182进行磷酸化修饰。通过AlphaFold 3模拟SnRK2.6两个酪氨酸残基进行磷酸化修饰，发现其与ABI1互作界面发生了翻转(图 4)。这表明BIK1可能通过对SnRK2.6的Y163和Y182磷酸化修饰解除PP2C对SnRK2.6的抑制。
图4. Y163和Y182磷酸化修饰解除PP2C对SnRK2.6的抑制
由于酪氨酸位点的特殊性，难以通过点突变模拟酪氨酸位点磷酸化后的状态。SnRK2.6的Y182D和Y182F突变均导致其丧失激酶活性，然而，Y163F突变的SnRK2.6的激酶活性有所增强，且ABI1和PP2CA对其抑制减弱。突变体回补实验中，仅Y163F突变的SnRK2.6可以回补ost1/snrk2.6突变体的失水表型。PP2C主要通过一个色氨酸（Trp，W）残基与SnRK2.6的Y182等残基发生互作，当突变为丙氨酸（Ala，A）或者精氨酸（Arg，R）时，PP2C和SnRK2.6的互作明显减弱，且PP2C对SnRK2.6的抑制能力减弱。这些结果进一步说明Y163和Y182残基对PP2C-SnRK2互作的重要性，并为调控作物抗旱性提供重要的基因编辑靶点。
综上，该研究通过自下而上的研究方法，鉴定到渗透信号解抑制SnRK2.6的核心蛋白激酶BIK1，并发现BIK1通过磷酸化SnRK2.6的两个酪氨酸残基，解除了PP2C磷酸酶对SnRK2的抑制(图 5)。该研究是赵杨研究组在发现质膜定位的渗透信号上游元件OSMO1/BON1 (Current Biology, 2020)，解析根冠比、避逆性等渗透信号开源应答机理之后 (Nature Plants, 2022; Developmental Cell, 2022)，进一步在渗透早期信号取得的新的突破，为提出渗透信号“复合信号”假说 (JIPB, 2024)，并继续鉴定渗透信号感受复合体和理解其感受机制提供了线索。
图5.渗透胁迫下BIK1解抑制SnRK2.6的模式图
本文转自ThePlantCell公众号，只为分享交流，无任何商业用途。点击左下角“阅读原文”查看论文全文。
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