北大韩敬东课题组13+分：应用单细胞RNA测序揭示超级百岁老人的衰老秘密

衰老是一个复杂的生物体功能衰退过程，伴随着许多退行性疾病。衰老时钟是基于组学数据训练的线性或非线性模型，用于预测年龄和衰老速率。现有的衰老时钟，如血液转录组、蛋白质组和DNA甲基化等，已经在不同程度上预测了生物学年龄。然而，衰老速率的异质性有多少是由单细胞水平的异质性贡献的，这一点尚未得到研究。尽管已有单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析比较了年轻和老年个体的单细胞水平变化，但这些数据无法建立年龄和衰老速率的预测模型。超级百岁老人（SCs）是一个特殊的群体，他们不仅寿命超过110岁，而且在非常老的年龄时仍然健康活跃。

原名：Human PBMC scRNA-seq–based aging clocks reveal ribosome to inflammation balance as a single-cell aging hallmark and super longevity

译名：基于人类外周血单核细胞的单细胞RNA测序的衰老时钟揭示了核糖体与炎症平衡作为单细胞衰老的标志，并与超级长寿相关

发表期刊：Science advances

影响因子：13.6

发表时间：2023-06-28

通讯作者：刘中民/韩敬东

通讯作者单位：同济大学/北京大学

DOI：10.1126/sciadv.abq7599

1.scRNA-seq揭示了衰老队列中的细胞类型组成

这项研究通过收集不同年龄段个体的PBMC样本并进行单细胞RNA测序，旨在构建一个能够预测个体生物学年龄的衰老速率模型。首先对来自17名年龄在28至77岁之间的个体的PBMC样本进行了高通量单细胞测序，然后与已发表的中国年轻队列、武汉队列、日本老年队列和超级百岁老人队列的数据进行整合分析（图1A）。

在数据预处理阶段，过滤掉质量不佳的细胞，并在去除批次效应后，成功地鉴定了包括红细胞、巨核细胞和六种主要的免疫细胞谱系—CD4+ T细胞（TC）、CD8+ T细胞、自然杀伤细胞（NK）、单核细胞（MC）和树突状细胞（DC）在内的不同细胞类型。通过UMAP技术，将这些细胞在降维空间中进行可视化，确保了不同数据集中的细胞类型是可比的，且不受特定批次效应的影响（图1B）。

2.重新聚类分析来剖析免疫细胞亚型

对不同免疫细胞亚型进行了详细的分类和分析。对NK细胞、T细胞、B细胞以及髓系细胞（包括单核细胞和树突状细胞）进行了重新聚类，基于每个聚类中最显著上调的基因，总共鉴定了29种不同的细胞亚型。

在T细胞亚群中，CD4+ T细胞和CD8+ T细胞被进一步细分为不同的亚型，包括幼稚T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞和细胞毒性T细胞。NK细胞也被细分为六个亚型。B细胞亚群包括不同的幼稚B细胞、记忆B细胞、浆细胞和与年龄相关的B细胞。髓系细胞被细分为不同的单核细胞和树突状细胞亚型（图1B）。

图1 人类外周血单个核细胞在衰老过程中的单细胞RNA测序概览。(A) 人类血液PBMC scRNA-seq衰老时钟分析的研究设计和流程图。将来自SE、中国年轻队列（CYCT）、武汉队列（WHCT）、日本老年队列（JOCT）和超级百岁老人（SC）队列的scRNA-seq数据合并，以对细胞类型进行分类，然后通过TOSICA将细胞类型注释转移到额外的队列进行进一步分析。绿色条表示每个队列的年龄范围。(B) 所有队列PBMC的scRNA-seq数据的二维均匀流形近似和投影（UMAP）可视化。每个点代表一个细胞；颜色细胞亚型注释。(C) 八大主要细胞类型的差异表达基因的表达水平。每个点的颜色和大小分别代表标记基因的表达水平和细胞比例。(D) 在不同队列中显示的C中的细胞类型比例。细胞类型频率用白色文字标注。

3.基于细胞类型比例的时钟模型显示，超级百岁老人（SCs）的生物学年龄远比他们实际年龄年轻

通过分析单细胞RNA测序数据中的细胞类型比例（图2A），构建了一个预测个体生物学年龄的“时钟”。首先使用偏最小二乘回归（PLSR）模型，并结合留一法交叉验证（LOOCV）来评估模型的准确性。为了提高模型的泛化能力并防止过拟合，只考虑了贡献最大的前三个主要成分。

通过计算变量在投影中的重要性（VIP），识别了对模型贡献显著的细胞类型，包括NKGZMH、CD8-CTL、CD8-Naive、CD4-Tm、CD4-Naive、Naive-B、NK-FCER1G、CD14-MC和Memory-B-CRIP1（图2B）。为了扩大训练数据的年龄范围，还包括了广东医科大学（GM）生成的包含非常老的样本的PBMC数据集。

研究发现，基于前7个细胞类型的三组分PLSR模型在预测和实际年龄之间的相关性非常高（PCC为0.88），平均绝对差（MAD）为8.36岁（图2C）。通过饱和度分析，确认了用于构建时钟的28个参考样本足以达到稳定的高准确性。

此外，还使用EN回归线性模型进行了训练，并发现基于前7个细胞类型的EN模型在预测年龄方面与PLSR模型同样准确。两种模型在预测准确性上的高度一致性表明了这些细胞类型在通过血液细胞类型组成进行年龄预测中的关键作用。

基于细胞类型组成的PLSR和EN模型来评估不同疾病状态下个体的生物学年龄。研究发现，与健康对照组相比，COVID-19和SLE患者的生物学年龄更高（图2E），且这种差异随着疾病严重程度的增加而更加显著（图2E至G）。这表明，这些时钟模型能够识别出与免疫相关的生物学年龄在疾病中的增加。

研究还发现，在超级百岁老人（SCs）中，CD8+ T细胞的两个亚型（CD8+ CTL和CD8+ naive T细胞）之间存在显著的负相关性，这与年龄相关的变化一致（图2D）。SCs的这些细胞亚型与70至100岁的健康老年人相似，表明在血液细胞群体水平上，CD8+ naive T向CD8+ CTL的转变可能是衰老的一个标志（图2H）。

图2 单细胞RNA测序数据构建的衰老时钟，以及超级百岁老人（SCs）的生物学年龄与实际年龄之间的关系。图2A：展示了所有SE样本中，年龄与细胞类型比例之间的Spearman秩相关系数，突出显示了与年龄相关性较强的细胞类型。图2B：展示了在构建偏最小二乘回归（PLSR）衰老时钟模型时，不同细胞类型的变量重要性。图2C：通过PLSR模型，在SE和GM样本上训练并交叉验证了衰老时钟，以预测个体的生物学年龄。图2D：比较了独立队列个体的实际年龄和PLSR模型预测的生物学年龄。图2E：比较了COVID-19轻症和重症患者与健康对照组的日历年龄和预测年龄差异。图2F：展示了COVID-19患者在恢复期和进展期的预测年龄差异。图2G：比较了系统性红斑狼疮（SLE）患者在不同治疗状态下与健康对照组的预测年龄差异。图2H：分析了CD8+ T细胞中两种亚型（CD8-CTL和CD8-Naive）的比例在SE、GM和SC样本中的负相关性。

4.与年龄相关的细胞组成变化在超级百岁老人（SCs）中被延迟

利用自然衰老队列衍生的时钟模型来分析超级百岁老人（SCs）的细胞和分子特征，以了解他们长寿的原因（图3A）。通过PLSR时钟模型预测了110岁时的细胞类型组成，并定义了与年龄显著相关的细胞类型。发现SCs在某些细胞类型的比例变化上显示出与年龄相关的延迟，这可能与他们的长寿有关。

具体来说，SCs在CD8+ naive T细胞、Naive B细胞、Memory B细胞和NK-GZMK细胞的减少以及CD4+ Tm细胞的增加方面显示出延迟，这与正常衰老过程中的预期变化不同。这些延迟的变化可能有助于维持SCs的健康和功能，从而促进他们的长寿。

5.在超级百岁老人（SCs）中，与年龄相关的单细胞基因表达变化被延迟

通过分析超级百岁老人（SCs）的单细胞基因表达数据，构建了基于PLSR模型的伪批量转录组时钟模型，用于预测个体的生物学年龄。研究发现，SCs的生物学年龄比他们的实际年龄年轻，这表明他们的细胞在衰老过程中显示出延迟的基因表达变化。

首先使用PLSR模型预测了28个训练样本的生物学年龄，并发现预测结果与实际年龄高度相关（图3B）。然后，他们分别对每种细胞类型的基因表达总和进行了PLSR模型训练，得到了不同细胞类型的生物学年龄预测，这些预测结果显示SCs的生物学年龄在年龄校正前和校正后都显著低于他们的实际年龄（图3C）。

为了进一步探索与SCs极端长寿相关的基因表达特征，定义了与年龄相关的上升和下降基因，并分析了这些基因在SCs中的表达是否延迟。他们使用LR模型预测了这些基因在110岁时的表达水平，并定义了“SC延迟衰老上升基因”和“SC延迟衰老下降基因”(图3A)。

通过转录因子靶标富集分析和KEGG途径富集分析，研究发现了一些在SCs中延迟的生物学途径，包括NFκB/TNF信号通路、病毒感染、凋亡和细胞因子信号通路（图3D）。而随年龄下降的基因最常见地富集于核糖体基因，这些基因在SCs的大多数细胞类型中显著延迟（图3E），这些延迟的基因表达变化可能有助于维持SCs的细胞功能和减少与年龄相关的炎症，从而促进他们的长寿。

6.在超级百岁老人（SCs）中，炎症性的细胞间相互作用受到抑制

探讨衰老过程中细胞间通讯的变化，特别是在超级百岁老人（SCs）中。利用CellphoneDB工具和配体-受体数据库，分析了不同细胞类型之间的配体-受体对的数量和功能，发现这些通讯方式在衰老过程中发生了显著变化。

研究结果显示，与炎症、细胞因子和抗原呈递相关的配体-受体对在衰老时往往会增加。这可能与慢性炎症状态有关，这种状态与多种年龄相关疾病的风险增加有关（图3F）。

在SCs中，观察到这些与年龄相关的配体-受体对的上调趋势被延迟，这可能有助于他们维持免疫细胞的稳态和功能。aMb2整合素信号通路和TNF信号通路在SCs中的延迟上调，特别是在浆细胞样树突状细胞（pDC）中，可能有助于减少炎症反应和相关的组织损伤（图3G）。

图3超级百岁老人（SCs）的细胞类型比例和基因表达变化与衰老的关系。图3A：SCs中细胞类型比例和基因表达变化的延迟衰老特征。图3B：基于SE和GM样本的伪批量转录组数据训练的PLSR年龄预测模型。图3C：使用PLSR模型预测了SCs的生物学年龄，并与他们的实际年龄进行了比较。图3D和E：通过KEGG途径分析，研究了SCs中随年龄上调和下调的基因。图3F：使用Circos图展示了随年龄显著变化的细胞类型间的相互作用网络。图3G：特别关注了SCs中随年龄上调或下调相互作用的细胞类型。

7.核糖体/翻译在单细胞水平上对抗炎症

研究单细胞衰老过程中核糖体水平下降与炎症水平上升之间的关系。通过计算每个细胞的炎症评分，并分析其与核糖体基因表达水平的相关性，发现两者之间存在显著的负相关性（图4A）。此外，在不同细胞类型中，平均核糖体水平和平均炎症评分之间也存在显著的负相关（图4B），这表明，在衰老过程中，核糖体水平的下降与炎症水平的上升可能是相互关联的。

进一步将细胞类型分为高炎症低核糖体（HI-LR）和低炎症高核糖体（LI-HR）两类，并发现在超级百岁老人（SCs）中，HI-LR细胞类型的核糖体表达水平与年轻个体相似（图4C），这可能是他们长寿的一个特征。这种高核糖体状态可能有助于维持细胞的蛋白质合成能力，从而抵抗炎症和延缓衰老。

此外，通过主成分分析（PCA），研究发现在大多数细胞类型中，单细胞可以根据核糖体和炎症基因表达水平被分为高核糖体和低核糖体两种状态。在SCs中，高核糖体状态的细胞比例较高（图4D），这可能有助于他们维持较低的炎症水平。或者更准确地说，更多处于高核糖体状态的细胞，是血液中单细胞水平上的超级长寿的共同特征。

研究揭示了细胞核糖体水平与细胞间通讯之间的联系，并发现在不同细胞类型中，高核糖体状态和低核糖体状态下的细胞间通讯模式存在显著差异。在低核糖体状态下，特别是CD8-CTL细胞与其他细胞类型之间的通讯更为活跃，涉及多种免疫相关分子，如MHCII、S100A8/A9-TLR4、CCL5-CCR5和TNF等。这些分子在免疫反应和炎症过程中起着关键作用（图4E）。

相比之下，在高核糖体状态下，这些配体-受体对的活性显著降低，表明核糖体水平可能对细胞间的免疫通讯具有调节作用。特别是，核糖体蛋白S19（RPS19）与其膜受体C5AR1之间的相互作用在高核糖体状态下下调，这种相互作用已被报道能够抑制免疫反应。

使用贝叶斯网络（BN）模型来探索衰老过程中核糖体水平、炎症水平、年龄和衰老速率之间的复杂关系。研究分析了SE + GM数据集中的HI-LR（高炎症低核糖体）和LI-HR（低炎症高核糖体）细胞类型，发现核糖体水平和炎症水平与衰老速率有显著的相关性。

模型还推断，在HI-LR细胞中，核糖体水平的下降会增加炎症水平。在LI-HR细胞类型中情况并非如此，那里的年龄减少炎症评分，炎症评分不贡献于衰老速率（图4F）。这些表明，高水平的炎症细胞因子表达可能是HI-LR细胞类型生长停滞或基本低核糖体活动不足的结果，而SCs可能受益于高细胞核糖体/翻译/生长速率来抵消衰老引起的慢性炎症。相反，基本低水平的炎症细胞因子可能不是诱导炎症状态，而是LI-HR细胞正常生长的结果（图4F）。为了每种细胞类型推断的BN模型中可以一致观察到类似的关系，并且基于这些BN中的相互作用，HI-LR细胞类型通过无监督层次聚类自动聚集在一起，并与其他细胞类型分离（图4G）。

通过实验方法验证了核糖体活动（翻译）在HI-LR细胞中对炎症的抑制作用。使用了翻译抑制剂环己亚胺（CHX）来抑制翻译过程，并观察了这一抑制对炎症细胞因子IL-6和IL-8表达的影响。

实验结果表明，在人血原代单核细胞和THP-1单核细胞系中，抑制翻译过程会导致IL-6和IL-8的表达随时间显著增加。这些结果与贝叶斯网络（BN）模型的预测一致，即核糖体活动（翻译）在HI-LR细胞中具有抑制炎症的作用（图4H）。

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