Comprehensive metabolomics expands precision medicine for triple-negative breast cancer
摘要
代谢重编程是癌症的一个标志。然而，仍然缺乏三阴性乳腺癌（TNBC）代谢物的系统表征。作者分析了330个TNBC样本和149个配对正常乳腺组织中的极性代谢组和脂质组，以构建TNBC的大型代谢组图谱。结合先前建立的同一队列的转录组学和基因组学数据，进行了将TNBC代谢组与基因组学联系起来的综合分析。研究将TNBC分为三个不同的代谢组学亚组C1、C2、C3。基于这个新开发的代谢组学数据集，作者提炼了以前的TNBC转录组学亚型，并确定了一些关键的亚型特异性代谢物作为潜在的治疗靶点。对患者来源的类器官和异种移植模型的实验表明，靶向神经酰胺途径的中间体鞘氨醇-1-磷酸（S1P）是一种很有前途的转录组学管腔雄激素受体亚型（LAR）肿瘤疗法；N-乙酰-天冬氨酰-谷氨酸酯（NAAG）是高危转录组基础样免疫抑制（BLIS）肿瘤的潜在治疗靶点。研究揭示了TNBC代谢组学的临床意义，它不仅可以优化转录组学亚型系统，还可以提出新的治疗靶点。该代谢组学数据集可以作为促进TNBC精准治疗的有用公共资源。
介绍
方法
样本：330名TNBC患者的极性代谢组和脂质组数据（其中MPS1有95名，MPS2有133名， MPS3有132名）和149个配对的正常组织数据。共注释了594种极性代谢物，1944种脂质。
图1. TNBC 中极性代谢组和脂质组检测概述
结果
一、代谢组学景观：
1.差异分析和相关性分析
作者鉴定了452种代谢物（肿瘤中 417 种较高，35 种较低）在肿瘤和正常样本之间显示出显著的丰度差异。与氧化反应和糖基转移相关的极性代谢物，如GSSG（氧化谷胱甘肽） 、UDPG（尿苷二磷酸葡萄糖）富集于TNBC，脂质中，PI（磷脂酰肌醇）、FA（脂肪酸）和神经酰胺也富集于TNBC。作者进行了 Spearman 相关性分析，该分析表明属于同一亚类的脂质根据其丰度密切相关，因将同一亚类的脂质视为一个整体，以进行后续的脂质组学分析。
2.差异丰度分析
基于 KEGG 代谢途径的差异丰度 （DA） 分析显示大量参与甘油磷脂代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢途径的代谢物表现出较高的 DA 评分。
3. 相似性网络融合
作者采用相似性网络融合探索TNBC 瘤间代谢组学异质性通过该分析，TNBC 可以明确分为三个亚组。代谢组学 C1 亚型以鞘脂和 FAs 富集为特征，代谢组学 C2 亚型以碳水化合物代谢和氧化反应上调为特征，与正常组织相比，代谢组学 C3 亚组表现出轻微的代谢差异。在能量代谢方面，代谢组学 C1 肿瘤表现出丰富的长链和不饱和 FA，可能更依赖于脂肪酸代谢;代谢组学 C2 肿瘤在谷氨酸途径中的代谢物相对更丰富，可能更多地依赖于谷氨酸代谢;与正常组织相比，代谢组学 C3 肿瘤的代谢组学差异较小。
图2.三阴性乳腺癌的代谢组学景观
二、代谢组+转录组综合分析
1.作者基于 Recon3D 数据库分析极性代谢物丰度与配对代谢基因 mRNA 表达之间的相关性，结果显示为弱相关性，这反映了代谢网络的复杂性。
2.作者研究了24个已知的癌症相关基因，这些基因在TNBC中经常发生突变，并应用线性回归模型研究体细胞突变和代谢物丰度之间的关联。可以发现最常见的TP53突变与分析的代谢物呈弱相关，PIK3CA突变和FA丰度呈正相关，与GSSG呈负相关。
3.在拷贝数方面，SCNAs 与代谢物之间的关联通常不强，作者只鉴定了几个 TNBC 特异性 SCNA 峰与代谢物丰度有关。9p23 染色体区域（致癌基因NFIB所在）拷贝数与GSSG，Maltotryose，GDP-M正相关；12p13.33染色体区域（起神经递质转运蛋白的作用的SLC6A12/SLC6A13的编码基因）拷贝数与NAAG（N-乙酰-天冬氨酸-谷氨酸）和GABA的丰度正相关。
。
图3.将极性代谢组和脂质组与基因组特征联系起来的系统评估
进一步探讨代谢组学亚型（C1，C2，C3）、转录组学亚型（BLIS，LAR，MES，IM）、基于代谢途径的亚型（MPSs）与TNBC复发的关联。作者发现LAR亚型和代谢组学C1亚型重合；BLIS、IM、MES亚型和C2与C3亚型重合。MPS1亚型和C1亚型重合，MPS2与MPS3亚型和C2与C3亚型交错。
作者采用多因素 Cox 回归模型进行分析BLIS 肿瘤患者无复发生存期（RFS）和预后因素的关联，发现在BLIS肿瘤中，C2亚型RFS差，且代谢组学亚型仍是独立的预后因素。由于BLIS和C2与C3重合，作者用机器学习的方法为BLIS构建一个简化的代谢组学亚型系统，用来区分C2和C3代谢组学亚型。测试队列运行效果良好。机器学习方法可以区分两种亚型。现在可以知道，对于 LAR 肿瘤，可以根据代谢组学 C1 亚型的特征对代谢靶点进行进一步探索。对于 BLIS 患者，通过机器学习将他们分为具有不同复发风险的C2，C3组再进行探索。
图4.代谢组学亚型优化了先前的转录组学亚型，通过机器学习实现C2和C3型区分
三、探索治疗靶点
1. 鞘氨醇-1磷酸（S1P）是转录组学亚型LAR的潜在靶点
转录组学亚型LAR与代谢组学亚型C1重叠（鞘脂丰富）。因此，针对鞘脂代谢途径的详细中间产物分析出LAR肿瘤中，神经酰胺富集。进一步通路分析表明神经酰胺通路的从头合成和降解在 LAR 肿瘤中更活跃，而糖基和磷酸基团的转移没有显著上调，表明神经酰胺通路的从头合成和降解在 LAR 肿瘤中起关键作用。作者对该通路中的关键中间体进行了靶向检测，包括鞘氨醇、鞘氨醇和 S1P，以验证它们在 LAR 肿瘤中的富集，还利用稳定同位素示踪实验来说明 LAR 亚型中神经酰胺途径的活性从头合成和降解。 作者采用了以下方法验证S1P是潜在的治疗靶点（1）阻断实验：在细胞系和患者源性类器官（PDO）模型中进行实验，系统地阻断了神经酰胺途径中的从头合成和降解的每一步(丝氨酸的摄入、丝氨酸转化为神经酰胺、神经酰胺降解为 S1P 和 S1P 与 S1PRs 结合)。发现SPHK1（将鞘氨醇磷酸化为S1P的酶）抑制剂PF-543和FTY-720（神经酰胺通路多靶点药物）在LAR肿瘤中有显著的效果。
（2）靶向效能验证：使用LAR细胞系MDA-MB-453和non-LAR细胞系LM2-4175，通过量化SPHK1抑制剂处理后S1P水平的下降来验证靶向效能。还通过沉默SPHK1来进一步确认S1P水平的变化和对肿瘤生长的影响。
（3）体内模型测试：使用小型患者源性异种移植瘤（mini-PDX）模型来测试PF-543和FTY-720的疗效。这些模型能够模拟人类肿瘤的微环境，提供了一个更接近临床情况的测试平台。研究结果与PDO模型中观察到的结果一致，表明LAR亚型的mini-PDX模型对这些药物更敏感。确定了S1P是治疗靶点。
图5. LAR 亚型中的神经酰胺代谢分析显示 S1P 是潜在的治疗靶点
2. 将 NAAG 鉴定为 BLIS 肿瘤中重要的促肿瘤代谢物
通过分析特异性上调并预测 BLIS 肿瘤预后不良的代谢物，作者将 NAAG 确定为潜在候选者，并通过化学标准进一步验证了它。有报道显示RIMKLA和RIMKLB两种酶负责产生NAAG，由于RIMKLB在转录组水平上高于RIMKLA，且与NAAG的丰度呈正相关，因此推测RIMKLB是关键酶。作者采用RIMKLB高表达的HCC1806和LM2-4175细胞系。用shRNA敲低高表达细胞系的RIMKLB时，NAAG丰度降低，同时癌细胞生长速率以及迁移和侵袭能力降低。再向培养基中注入NAAG后，抑制作用被减弱。RIMKLB 和 NAAG 的作用在体内得到进一步验证。敲低 RIMKLB 后，肿瘤的生长显著减慢，体积和重量都有所减少，并且通过 NAAG 补充剂部分挽救了肿瘤生长。这些数据表明，NAAG 是 BLIS 肿瘤中重要的促肿瘤代谢物，靶向 NAAG 的生物合成可能是一种可行的治疗策略。
图6. 将 NAAG 鉴定为 BLIS 肿瘤中重要的促肿瘤代谢物
讨论
本研究通过构建大型代谢组学数据集，揭示了三阴性乳腺癌（TNBC）的代谢组学特征和异质性。研究发现，TNBC的代谢物丰度总体增加，与其他肿瘤类型不同，且特定代谢物如UDPG和GDP-甘露糖在TNBC中显著增加，表明糖基化失调是TNBC的特征。通过结合基因组和转录组数据，研究揭示了代谢物与基因组改变之间的相关性，如PIK3CA突变驱动的脂肪酸产生和NFIB扩增与GSSG富集的关联。此外，研究还确定了S1P和NAAG作为LAR和BLIS亚型TNBC的潜在治疗靶点。尽管研究存在局限性，如代谢组学检测技术的优化空间，但通过多组学数据分析和功能实验，本研究为TNBC的精准医学提供了新的见解和潜在的治疗策略。
