我国是柑橘重要起源中心和遗传多样性中心，资源类型丰富。柑橘种间/内自然杂交频繁，导致遗传背景十分复杂，尽管前人对柑橘的起源和进化已有了一定研究，但仍存在争议。2018年《Nature》报道，柑橘属起源于喜马拉雅山脉的东南麓，包括中国云南西部、印度阿萨姆东部和缅甸北部等地区 (Wu et al., 2018)。《Nature Genetics》2023年报道，古印度板块可能是柑橘亚科的起源中心，来自于中国中南部的宜昌橙 (Citrus ichangensis)、莽山野柑 (C. mangshanensis)、枳 (C. trifoliata 或 Poncirus trifoliata)、金柑 (C. hindsii 或 Fortunella hindsii)、宽皮柑橘 (C. reticulata) 等被认为是早期分化的柑橘，该分布区域可能为柑橘属的初生起源中心，来自于喜马拉雅山东南麓 (分布有柚 (C. grandis 或 C. maxima) 和枸橼 (C. medica)) 和澳大利亚及其附近岛屿 (分布有澳指檬、澳沙檬等) 是柑橘属的两个次生分化中心 (Huang et al., 2023)。枸橼、柚和宽皮柑橘为柑橘属的三大原始种 (Wu et al., 2018; Huang et al., 2023)，起源于南岭山脉的莽山野橘 (C. reticulata) 是最原始的宽皮柑橘类型 (Wang et al., 2018)，大翼橙亚属 (Papeda) 为柑橘属的野生类型。不同柑橘种质资源通过种内、种间、属间的自然杂交及选择，逐渐形成了枸橼、柚、宽皮柑橘、莽山野柑、酸橙、甜橙、香橙、柠檬、黎檬、莱檬、葡萄柚等类型 (Wu et al., 2018；Huang et al., 2023)。然而，不同种之间的演化关系，种内如何进化等问题仍不清晰。
近日，JIPB在线发表了西南大学柑桔研究所联合云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所、福建农林大学、山西农业大学等单位题为“Haplotype-resolved genome of a papeda provides insights into the geographical origin and evolution of Citrus”的研究论文 (https://doi.org/10.1111/jipb.13819)，为柑橘物种的起源和进化提供了新的见解。
研究团队从云南省西双版纳傣族自治州景洪市阿旦山的原始森林中发现一株树龄超200年的大翼叶柑橘，树体高约12 m，树干直径约40 cm，本叶长与翼叶长的比值为1.58；花朵丛生在茎上，花瓣淡紫色，花丝分离，花药黄色、饱满，花粉多，部分花雌蕊败育 (图1)。亲缘关系分析发现，西双版纳大翼橙与马蜂柑、马来西亚大翼橙具有较近的亲缘关系 (图4A)。因此，表型和基因型数据表明，西双版纳大翼橙属于柑橘属的大翼橙亚属 (图2)。溯祖分析发现 (图2C)，以西双版纳大翼橙为代表的大翼橙 (Papeda species) 分化时间大约为750万年前，比宜昌橙 (Ichang papeda) 更早分化出来，是柑橘属中最原始的类型。
基于Pacbio Sequel II平台、Hi-C文库和Illumina HiSeq X Ten平台测序数据，组装出294 Mb的染色体级别的西双版纳大翼橙基因组，Benchmarking Universal Single-Copy Ortholog (BUSCO) 完整性高于98%，LTR assembly index (LAI) 得分高于 21.1 。发现了5.6 Mbp (1.2%) 的变异，包括175万个SNPs、149471个插入和154215个缺失 (图3)。通过功能基因比较，在单倍型1和单倍型2中分别发现了535个和499个单倍型特异性基因。
A. 两个单倍型基因组之间的结构差异；B. 不同组织的等位基因特异性表达基因的韦恩图；C. 单倍型Hap1的chr3和单倍型Hap2的chr6之间发生的易位事件
基于组装的西双版纳大翼橙核基因组和叶绿体基因组，对来源于国家柑橘种质资源圃 (重庆) 和云南收集的涵盖所有柑橘类型的378份材料 (1份外类群重测序来源于NCBI) 进行重测序，开展种群结构、系统进化、溯祖、杂种起源、亲缘关系鉴定、苦味的选择性清除等分析。
系统发育树显示 (图4B)，除了莽山野柑，柑橘属分为两个进化支，一支以宜昌橙、宽皮柑橘、香橙、甜橙等类型为代表，另一支主要包括大翼橙、澳指檬、澳沙檬、枸橼、红河大翼橙、柚、酸橙等类型。在柑橘属两个进化支中，最原始的大翼橙亚属在云南南部的原始森林中均有分布，如：分布在云南西双版纳的马蜂柑、西双版纳大翼橙等大翼橙，分布于云南红河的元江宜昌橙，这些类型与发现于云南临沧的柑橘化石 (C. linczangensis) 具有较近的地理位置。结合系统发育分析、物种分化时间、地理起源等数据，推测柑橘属植物从起源中心朝东南亚和中国东部两个方向进行演化和传播 (图4C)。第一个方向是通过澜沧江和红河等水系向东南亚国家进行传播，演化形成类型丰富的柚类和大翼橙资源；第二个方向是经过珠江、长江等水系向东进行传播和演化，形成类型丰富的宜昌橙、柚、宽皮柑橘、酸橙、香橙、甜橙等柑橘种质资源。
A. 378个柑橘材料的全基因组进化树，Chinese box orange为外类群， 聚类树外围环上的条形图分别为汁胞(蓝色)和囊衣(红色)的苦味值，比例尺表示苦味值；B. 柑橘代表性物种的分化时间树；C. 柑橘属的进化和传播路线
研究团队基于重测序数据对这些材料的遗传背景进行了分析。发现枸橼之间存在大量的基因流 (图5)，尼泊尔和印度尼西亚的枸橼可能通过丝绸之路从四川传播过去，大翼橙和四川的枸橼可能是澳指檬的亲本。分布于云南元江原始森林的元江宜昌橙在宜昌橙的进化中扮演重要角色。来源于云南昭通、贵州、湖南等地的宜昌橙与元江宜昌橙具有较近的亲缘关系，元江宜昌橙可能是重庆、湖南、广西等地方宜昌橙的母本，并通过珠江、长江传播到下游，在重庆、湖南、广西等地演化成宜昌橙杂种，比如广西田林的大种橙。同时，柑橘的属与属之间也易杂交，序列相似性分析发现，柑橘属的莽山野柑、元橘与柑橘属的宜昌橙和金柑属有较高的序列相似性，金柑属的融安金柑的基因流流向柑橘属的莽山野柑和元橘 (图6)，这些发现刷新了对莽山野柑和元橘的认识，它们可能不应被归为宽皮柑橘类型。作为宽皮柑橘中最原始的莽山野橘，其基因流显著流向湖南道县和江西的野生宽皮柑橘 (图6)，野生、半野生和栽培宽皮柑橘之间也存在大量的基因流 (图7)，基因流的流向与水系走向趋于一致。表明宽皮柑橘从南岭山脉开始，借助长江及其支流，逐渐进化和传播形成各种类型的宽皮柑橘。这些结果表明，大多数柑橘为自然杂交形成，存在广泛的基因流。
图5. 不同类型枸橼之间的基因流分析
对柑橘汁胞中的苦味程度进行感官评价，较原始和野生的柑橘具有较大的苦味值，比如大翼橙、宜昌橙、红河大翼橙、枳、酸橙、部分柚等，柠檬、宽皮柑橘、甜橙等基本没有苦味 (图4A)。选择性清除分析 (XP-CLR) 发现，一些参与类柠檬苦素和类黄酮生物合成的4-香豆酸-CoA连接酶、花青素还原酶、糖苷转移酶等基因在柑橘驯化过程中受到了选择 (图8)。
图8. 不同苦味值柑橘之间的选择性清除分析
本研究进一步证实喜马拉雅山脉的东南麓是柑橘属的起源中心，发现：(1) 大翼橙是柑橘属最先分化的原始柑橘类型，代表性材料-西双版纳大翼橙的两个单倍型基因组之间存在大量基因缺失、结构和SNP变异；(2) 宜昌橙、枸橼、宽皮柑橘等种内存在大量的基因交流；(3) 柑橘属从起源中心借助河流，分别朝东南亚和中国东部进行传播和演化，形成各种柑橘类型；(4) 果实的苦味在柑橘驯化过程中受到选择。该研究为柑橘的起源和进化提供新的证据，为柑橘育种和品种改良提供丰富的基因组资源。
西南大学柑桔研究所王福生副研究员、云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所王绍华副研究员、福建农林大学吴一磊博士为论文共同第一作者，福建农林大学刘仁义教授、西南大学柑桔研究所朱世平副研究员，山西农业大学程春振教授为论文共同通讯作者。西南大学柑桔研究所江东研究员、李贵节副研究员和程玉娇副研究员参与了该研究。该研究获得现代农业产业技术体系项目 (CARS-Citrus)、国家自然科学基金项目 (32060664、31901995)、中央高校基本科研业务费项目 (SWU120021、SWU-XDJH202308) 和福建农林大学人才项目等资助。特别感谢陈竹生研究员、洪棋斌副研究员、张云贵研究员在柑橘进化提出的宝贵意见。
参考文献：
Huang, Y., He, J., Xu, Y., Zheng, W., Wang, S., Chen, P., Zeng, B., Yang, S., Jiang, X., and Liu, Z. (2023). Pangenome analysis provides insight into the evolution of the orange subfamily and a key gene for citric acid accumulation in citrus fruits. Nat. Genet. 55: 1964–1975.
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