瓜叶菊miR156-PhSPL3调控花青素代谢的研究
孙丹旎，李好，崔宇萌，黄河
DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0325
近日，《生物技术通报》在线发表了题为《瓜叶菊miR156-PhSPL3调控花青素代谢的研究》的研究报告。本研究通过克隆PhSPL3及两个Ph-miR156前体基因，结合生物信息学和分子生物学技术，揭示它们表达模式和花青素积累的相关性，探究其参与花青素合成的可能机制，为miRNA在转录后水平调控观赏植物花色研究提供了理论支持。
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SPL基因广泛存在不同植物中。拟南芥和菊花分别有17和12个SPL家族成员。本研究将PhSPL3与上述SPL家族成员构建系统进化树进行聚类分析， 发现其与CmSPL3，AtSPL13a，AtSPL13b共同聚类在Clade Ⅶ分支上。该分支上的SPL基因均具有miR156靶点，AtSPL13a/b在植物营养生长时相转变与营养生长向生殖生长转变，调控发芽后子叶到营养叶阶段的过渡，控制叶片和叶柄沿近端-远端轴的发育等方面发挥作用；CmSPL3可能参与了对茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）等多种植物激素的反应。其他植物中聚类于该亚家族的SPL类基因也有报道调控花青素合成的功能。本研究通过分析PhSPL3在不同花色瓜叶菊舌状花的表达模式，发现它的表达与花青素积累呈正相关；在VIGS瞬时沉默后，花青素含量减少，花青素代谢途径相关的部分结构基因和转录因子表达降低，为SPL家族Clade Ⅶ分支成员在花青素调控方面的功能提供了新的证据。
花青素生物合成由结构基因和转录因子共同调控。研究发现，miR156-SPL模块可以通过调节花青素合成途径中的结构基因参与植物花色形态建成。前人研究发现，增强miR156活性可促进花青素的积累，AtSPL9作为miR156的靶基因负调控花青素合成，并且与花青素合成途径中的MYB-bHLH-WD40复合体中的MYB蛋白PAP1相互作用，抑制DFR的表达，形成miR156-AtSPL9-DFR信号通路影响花青素合成。在芍药中也证实了miR156-SPL-DFR三者之间的调控关系及作用机制。但在本研究中，沉默PhSPL3后发现PhDFR3的表达未发生显著变化，反而PhCHS2、PhANS、PhF3H1等结构基因的表达显著降低；同时，我们还观察到Ph-miR156的表达与瓜叶菊中花青素积累呈相反的趋势，并且可以靶向PhSPL3，降低其表达水平；进一步的实验结果显示，PhSPL3通过直接调控PhCHS2的表达来促进瓜叶菊中花青素的合成。这些发现揭示了miR156-SPL-CHS模块对花青素合成可能的调控机制。在观赏海棠中也发现，SPL13b可以通过结合CHS的启动子，进而调控花色素苷的积累。因此，我们推测miR156-PhSPL3能够通过调控PhCHS2等花青素结构基因的表达影响花青素含量。目前对miR156-SPL-CHS调控网络的研究较少，本研究结果为miR156-SPL模块在植物花青素合成调控的理解提供了新的视角。
除直接调控结构基因外，miR156-SPL还能通过结合花青素代谢转录因子的启动子或与转录因子互作来间接调控花青素的积累。在本研究中，沉默PhSPL3后发现PhbHLH17的表达显著降低，酵母单杂交实验也显示，PhSPL3通过直接结合PhbHLH17启动子来调控瓜叶菊中花青素的合成。本研究中也发现，PhSPL3能PhMYB5和PhMYB7互作，形成蛋白复合体。因此在瓜叶菊中，PhSPL3、PhbHLH17、PhMYBs及下游结构基因可能存在复杂的调控花青素合成机制，一方面PhSPL3与PhMYB5或PhMYB7互作，可能竞争性地阻止PhbHLH17与PhMYBs的结合，另一方面PhSPL3也可能与PhMYB5或PhMYB7形成新的蛋白复合体，增强对下游其他结构基因和调节基因的激活，从而进一步调控花青素的生物合成。
本研究从瓜叶菊中克隆获得PhSPL3基因，该基因具有一个SBP结构域，属于SPL亚家族Clade Ⅶ分支；克隆获得两个Ph-miR156前体基因，分别命名为Ph-MIR156a和Ph-MIR156b。PhSPL3在瓜叶菊玫色和蓝色品种的舌状花中高表达，在白色品种的舌状花中低表达，与Ph-miR156的表达呈负相关，Ph-MIR156a和Ph-MIR156b均可靶向PhSPL3，抑制其表达。miR156-PhSPL3通过调控花青素代谢分支上相关基因的表达，在瓜叶菊花青素物质的生物合成中发挥作用。
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