在生物研究领域，要深入理解细胞和深层组织中的生物活动，高速三维成像技术是不可或缺的工具[1-3]。传统的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）因其出色的光学切片能力，广泛应用于厚样本的生物成像研究[4, 5]。然而，由于CLSM通过逐点扫描构建图像，获取三维图像需要对多个光学切片逐层扫描，导致时间成本较高，难以满足三维动态生物事件研究对高时间分辨率的需求。为应对这一挑战，三维随机读取（random-access）显微镜应运而生，提供了高速三维动态成像的有效工具，推动了相关研究领域的发展[6, 7]。但现有的三维随机读取显微成像方案通常存在结构复杂、成本高昂以及缺乏多色成像能力等局限性，限制了其在生物学研究中的广泛应用。2024年11月11日，深圳湾实验室侯尚国团队联合上海交通大学仲冬平团队、南昌大学邓素辉团队，在Nature旗下期刊Communications Engineering上发表了题为“Three-dimensional random-access confocal microscopy with 3D remote focusing system”的研究论文。研究团队提出了一种新型的具有远程聚焦系统的三维随机读取共聚焦显微成像技术（3D-DyFI）。相比传统的三维随机读取成像方法，该技术在保持空间分辨率的同时，将轴向响应时间提升了34倍，实现了高达500 Hz的成像刷新率。
研究团队通过荧光微球、活细胞成像及不同位置荧光珠的监测实验，验证了3D-DyFI技术的有效性。该技术有望为细胞生物学、神经科学及疾病研究提供更加快速、精准的成像手段。并且该论文被选录于“Microscopic Imaging in Deep Tissue”专辑。3D-DyFI系统采用635 nm、561nm和488 nm激光作为激发光源，支持多色成像。如图1a所示，激光经消色差双合透镜扩束后进入三维动态聚焦系统（3D Galvo），该系统由两个正交振镜和一对平凹透镜组成，可精确控制激光焦点在三维空间中的位置。激光经扫描筒镜进入物镜，有效减少因振镜扫描带来的场畸变和像差。荧光信号经物镜收集，并通过三维动态聚焦系统实现去扫描，最后由雪崩光电二极管（APD）检测记录。实验结果显示，3D-DyFI的成像点扩散函数（PSF）与传统压电平台相当（图1b-c），验证了其高空间分辨率。图1d-f进一步表明系统在x、y、z轴的电压与焦点位置呈线性关系，证明了系统对激光焦点的精准控制和稳定性。![]()
图1. 3D-DyFI系统原理示意图、点扩散函数和线性表征为表征3D-DyFI的空间分辨性能，研究团队通过测量不同侧向和轴向位置的PSF，并在较大扫描范围（40μmx40μmx10μm）内验证了其分辨率均匀性。实验结果（图2）显示，3D-DyFI的平均空间分辨率在x、y、z轴分别为319 ± 55 nm、405 ± 56 nm和1.10 ± 0.11μm，且在整个成像范围内保持稳定。 ![]()
图2.在三维图像中进行不同位置的三维空间分辨率表征在时间分辨率方面，研究团队将3D-DyFI与传统压电平台系统进行对比，结果表明，3D-DyFI在x、y、z轴的响应时间分别为0.74 ms、0.82 ms和0.65 ms，显著优于传统系统（13.6 ms、9.3 ms和22.3 ms）。特别是在z轴上，3D-DyFI的响应时间提升了约34倍，实现了近乎各向同性的高速响应，这对于快速随机读取成像至关重要（图3）。![]()
图3.3D-DyFI和压电平台系统响应时间的比较分析研究团队进一步通过活细胞成像实验，展示了3D-DyFI在细胞结构（如细胞膜、线粒体、细胞微管和脂滴等）三维成像中的强大能力（图4）。与传统压电平台成像效果相比，3D-DyFI表现出高度一致性，验证了其在生物样本成像中的可靠性。 ![]()
图4.3D-DyFI对活HeLa细胞线粒体的三维成像在随机读取成像实验中，3D-DyFI与压电平台系统对比测试了三维空间中不同位置的荧光珠信号。结果显示，3D-DyFI的成像刷新率可达500 Hz，比传统系统快25倍，实现了对生物系统中动态事件的毫秒级观测（图5）。这种高速成像能力为研究细胞内快速变化的生物过程提供了强有力的工具。 ![]()
图5.3D-DyFI和压电平台系统的三维随机读取成像对比综上所述，3D-DyFI作为一种创新的三维随机读取共聚焦显微成像技术，展示了多方面的显著优势：（1）该系统通过远程聚焦避免了移动样品或物镜带来的机械运动干扰；（2）通过使用三维动态聚集系统，显著提升了三维随机读取成像速度；（3）系统搭建成本低，对预算不充足的实验室友好；（4）可进行多色成像和多光子成像。3D-DyFI有望在细胞生物学、神经科学等领域得到广泛应用，帮助实时监测细胞内分子动态变化。未来，3D-DyFI有望与其他技术融合，进一步提升性能，在生物医学研究中发挥重要作用。本研究得到了深圳市医学研究专项资金（B2301003）、国家自然科学基金（62065012, 22204106）、深圳湾实验室-EVIDENT联合光学显微成像技术开发项目（S234602004-4）、广东省基础与应用基础研究基金（2021A15151110710）及广东省珠江人才计划（2021QN02Z631）的资助。
参考文献
1. Gao, Z., Li, Q., Fan, C. & Hou, S. Deciphering live-cell biomolecular dynamics with single-molecule fluorescence imaging. Sci. Bull. 69, 2095–9273 (2024).
2. Hou, S. G., Johnson, C. & Welsher, K. Real-time 3D single particle tracking: towards active feedback single molecule spectroscopy in live cells. Molecules 24, 2826 (2019).
3. Liu, Z. C. et al. Structural and functional imaging of brains. Sci. China Chem. 66, 324–366 (2023).
4. Carlsson, K. et al. Three-dimensional microscopy using a confocal laser scanning microscope. Opt. Lett. 10, 53–55 (1985).
5. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I. & North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nat. Protoc. 15, 1585–1611 (2020).
6. Bansal, V., Patel, S. & Saggau, P. High-speed addressable confocal microscopy for functional imaging of cellular activity. J. Biomed. Opt. 11, 34003 (2006).
7. Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R. & Saggau, P. Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity. Nat. Neurosci. 11, 713–720 (2008).论文标题：Three-dimensional random-access confocal microscopy with 3D remote focusing system原文链接：https://www.nature.com/articles/s44172-024-00320-2
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