植物与病原菌之间的跨界蛋白质相互作用是植物免疫和病原菌感染机制研究中的重要领域。植物通过分泌防御相关的水解酶来抵抗病原菌的入侵，而病原菌则通过分泌小型分泌蛋白（SSPs）抑制这些水解酶，从而逃避植物免疫系统的监视。理解这种复杂的相互作用有助于揭示病原菌如何突破植物的防御机制，并为作物抗病性育种提供关键信息。跨界蛋白质相互作用的研究，不仅可以揭示植物-病原菌共进化的分子基础，还为设计新的病害防治策略提供了理论依据。近年来，人工智能（AI）技术，特别是AlphaFold-Multimer（AFM）等蛋白质结构预测工具，在这一领域取得了突破性进展。传统的实验方法，如酵母双杂交、免疫共沉淀等，往往耗时费力，且难以处理复杂的跨界蛋白质相互作用。借助人工智能和深度学习，研究者能够大规模预测植物与病原菌的蛋白质互作模式，极大地提高了研究效率。可以高效准确地预测植物与病原菌的相互作用，揭示病原菌如何抑制植物的防御酶。人工智能的应用不仅加速了我们对植物免疫机制的理解，还为作物改良和病害防治开辟了新的研究方向。
最近的研究“AlphaFold-Multimer
predicts cross-kingdom interactions at the plant-pathogen interface”通过AlphaFold-Multimer的预测和实验验证，该研究揭示了病原体如何通过SSPs抑制植物的关键防御蛋白质（如P69B）的机制，并提出了P69B是一个重要的效应器靶点。这些发现不仅展示了AlphaFold在生物交互领域的强大应用潜力，还为未来的作物改良和病害防治提供了新的思路。![]()
The Plant Chemetics Laboratory 是英国牛津大学生物系的一部分，由 Renier A. L. van der Hoorn 教授领导。van
der Hoorn 教授的研究主要集中在植物-病原体互作，特别是研究植物免疫系统中的蛋白水解酶及其抑制剂。通过分析植物防御反应中的酶活性，van der Hoorn 教授的团队致力于揭示植物如何识别并应对病原体入侵，并探索病原菌如何通过分泌效应子来抑制植物的免疫反应。研究结果
1、AFM成功区分现有与不存在的水解酶-抑制剂复合物为了验证AlphaFold-Multimer（AFM）在预测已知和虚构蛋白质复合物方面的准确性和可靠性。研究者选取了番茄防御蛋白P69B、Pip1与病原体Phytophthora
infestans分泌的Kazal样抑制剂Epi1a和EpiC2B作为已知复合物进行预测测试，并通过AFM计算其ipTM+pTM评分，以评估预测模型的准确性。
P69B-Epi1a
& Pip1-EpiC2B：P69B是一种番茄分泌的蛋白酶，在植物免疫中发挥重要作用。Epi1a是Phytophthora
infestans分泌的一种Kazal样抑制剂，它通过结合P69B的活性位点来抑制P69B的功能。Pip1是番茄中的一种半胱氨酸蛋白酶（papain-like protease），同样在植物防御中发挥作用。EpiC2B 是来自 Phytophthora infestans 的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，它与 Pip1 结合，抑制其活性。这种相互作用早已在实验中得到证实。因此，研究者选择这两对复合物作为验证AFM准确性的标准。AFM工具通过ipTM+pTM评分（0.93&0.92）分别准确预测了P69B-Epi1a和Pip1-EpiC2B的复合物。这一高分数与已知实验数据相符，表明AFM能够成功捕捉两者的相互作用。模型还显示，Epi1a通过其反应位点环与P69B的活性位点形成11个氢键，进一步确认了其抑制功能。为进一步测试AFM的区分能力，研究者对虚构的复合物进行预测。两组蛋白质结合方式进行交换组合，AFM的预测得分显著降低（0.47&0.48），表明两者无法形成有效的复合物。这验证了AFM在区分互作和不互作复合物时的有效性。同时通过plDDT（预测的局部距离差异测试）评分分析，研究者展示了互作复合物中的结合区域在结构上较为稳定（高plDDT分数，蓝色），而不互作复合物的结合区域则显示出较低的结构置信度（低plDDT分数，红色）。这种对比进一步支持了AFM能够准确识别有效的蛋白质复合物。![]()
图1：AFM正确的区分了现有和不存在的水解酶抑制剂复合物
2、利用AFM筛选11274个蛋白质对，鉴定到376个候选复合物在确定AFM可用作蛋白质互作筛选的平台后，研究者在7种不同的番茄病原体（包括真菌、细菌和卵菌）中筛选出1879种可能分泌的小型分泌蛋白（SSPs），并将其与6种番茄防御相关的水解酶进行配对。这6种水解酶包括番茄的几种蛋白酶（如P69B和Pip1）和几丁质酶，均在番茄感染期间分泌。使用AFM对11,274对蛋白质进行了预测（共消耗了13,244 CPU时和8118 GPU时，cosmic-cryoem.org）。通过分析ipTM+pTM评分，最终筛选出了376个候选复合物，这些复合物的评分均≥0.75。这些候选复合物占总筛选数的3.3%，这一比例较高，意味着大多数病原体能够针对每种水解酶产生多个抑制剂。同时也表明了AFM能够有效地识别潜在的蛋白质-蛋白质相互作用。![]()
图2：1879个 SSP 和 6 个水解酶之间的AFM 筛选确定了 376 个候选复合物
为了进一步对复合物的结构进行分析，研究者将376个复合物分为四类：
第一类（19个复合物）：被归为无意义模型，因为它们的多肽链互相缠绕，不符合实际的蛋白质结构特点。第二类（137个复合物）：这些复合物的底物结合槽完全暴露，SSP在水解酶的其他区域结合。尽管这些SSPs可能是水解酶的变构调节剂，但不被进一步分析。第三类（184个复合物）：这些复合物的活性位点被SSP阻断，但阻断活性位点的区域没有内在结构，表现为无结构的肽链。这些SSPs可能是蛋白酶的底物，但没有被进一步研究。第四类（36个复合物）：这些复合物中的SSP通过具有内在结构（通常含有多个二硫键的紧密折叠结构）阻断了活性位点。这一类的相互作用与已知的抑制剂-水解酶复合物相似，因此被进一步分析。随后研究者深入分析了从筛选出的36个复合物，发现了 8 个与P69B 结合的 Pi Kazal 样蛋白复合物，以及5 个与 Pip1 结合的 Pi 胱抑素样蛋白复合物，筛选方法不仅依赖于AFM模型预测，还通过手动分析蛋白质复合物的结构合理性来进一步验证预测结果。这种结合自动化模型和手动筛选的方式有效地验证了Kazal样抑制剂与P69B、以及半胱氨酸蛋白酶抑制剂与Pip1的复合物的可信度。这些复合物在结构上表现为抑制剂紧密结合防御酶的活性位点，支持了研究者的假设，即这些抑制剂能够通过阻止酶的催化功能来帮助病原体抑制植物的免疫反应。这些复合物的筛选和验证进一步支持了研究者的假设，即病原体通过一系列不同的抑制机制来阻碍植物的免疫防御功能。
为了进一步确认这些复合物在植物感染期间的实际存在，研究者从转录组数据库中挖掘了候选抑制剂在感染期间的表达水平。通过分析感染过程中的RNA测序数据，研究者发现23个候选抑制剂中的11个在感染期间表达，表达水平范围为2.4到599 TPM。这11个候选抑制剂最终被确定为最有可能的候选者，其中P69B被5个病原体产生的7个抑制剂靶向，被认为是一个重要的“效应枢纽”。![]()
图3：候选复合物的选择
4、4种P69B抑制剂的实验验证并且P69B可作为效应枢纽，承担植物防御核心功能在大肠杆菌 Rosetta-gami B 细胞中表达7 种候选 P69B 抑制剂，受限制于表达量和分子量，最终获得 4 种纯化抑制剂，分别是Xanthomonas perforans 产生的XpSsp1、Cladosporium
fulvum 产生的CfEcp36、Fusarium
oxysporum 产生的FoTIL 和FoSix15。
研究者使用了一种基于活性位点标记的实验方法，通过荧光标记探针FP-TAMRA来检测P69B的活性变化对4种抑制剂与P69B的互作进行了验证。旨在进一步验证这些抑制剂的作用机制，特别是在如何通过与P69B的活性位点结合来阻断其功能。这些抑制剂通过与P69B的活性位点结合，抑制了其酶的活性。每种抑制剂的作用方式和结构不同，表明病原体可以通过不同的机制来阻碍P69B的功能：
4.1
XpSsp1：XpSsp1与P69B的底物结合槽相互作用，阻断了其活性位点。这种抑制剂在植物病原体中高度保守，且在多个位点通过二硫键形成稳定结构。4.2
CfEcp36：CfEcp36使用双链结构占据了P69B的结合槽，并通过与活性位点周围的两个关键残基相互作用，避免被P69B水解。4.3
FoTIL 和 FoSix15：通过不同的残基占据了P69B的结合位点，FoSix15利用酪氨酸、亮氨酸和天冬酰胺残基在多个口袋中与P69B结合。实验表明，番茄P69B蛋白是一个多病原体靶向的“效应枢纽”，能够被来自不同病原体的多种抑制剂所抑制。不同病原体通过多样化的SSPs靶向P69B，反映了病原体对植物防御系统的长期适应性进化。这一发现不仅有助于理解植物-病原体的相互作用，还为作物抗病育种提供了潜在的应用策略。需要强调的是，AFM 产生的SSP-水解酶复合物的结构预测仍有待实验验证。这可以通过晶体学或 CryoEM 或与实验解析的蛋白质复合物进行比较来实现。![]()
图4：P69B的活性标记被四种抑制剂抑制
研究不仅揭示了植物与病原体之间复杂的蛋白质相互作用机制，还展示了AFM在预测跨界相互作用中的巨大潜力。P69B作为效应枢纽的发现，提供了提高作物抗病性的新方向。通过增强或保护这些核心防御蛋白的功能，未来有望开发出更具抗病能力的作物，为植物病害防治提供新策略。文章从分子层面揭示了植物与病原体相互作用中的关键机制，并通过实验验证了SSPs对P69B的抑制作用。研究不仅提升了我们对植物免疫系统复杂性和动态性的理解，也为未来通过生物技术手段提高作物抗病性提供了新的思路。这类研究表明，基础科学与尖端技术（如AlphaFold）的结合，能够帮助我们更深入地理解生物系统的工作机制，尤其是在探索复杂的植物-病原体相互作用上。AFM工具不仅加速了预测工作，而且通过大规模筛选，揭示了许多新的蛋白质复合物，为生物学研究打开了新的大门。
虽然AFM 不可避免的会产生假阴性分数，一些报道为互作的蛋白质复合物得分可能是由于某些蛋白质的的平均无间隙 MSA 深度较低而使得得分相对较低。但目前的一些局限性可以通过增加测序和进一步开发预测算法、评估和验证方法来进一步优化解决。随着这些预测工具的不断进化和精确性提升，类似的研究将进一步加深我们对生物系统复杂相互作用的理解。
AlphaFold的预测结果已经广泛应用于生物学、药学和结构生物学中，特别是在发现新的酶、受体及其抑制剂方面具有重要潜力。通过结合实验数据与计算预测，研究者可以更高效地验证蛋白质互作，节约了大量实验成本。尽管 AlphaFold 已达到很高的预测精度，但实验验证依然是不可或缺的一部分。未来，人工智能与实验技术的结合将使得 AlphaFold 在更广泛的领域如药物设计、基因编辑等发挥更大作用。预测互作位点将帮助开发新的蛋白质工程策略，产生对抗疾病的强效分子。原文链接：Homma, F., Huang, J.
& van der Hoorn, R.A.L. AlphaFold-Multimer predicts cross-kingdom
interactions at the plant-pathogen interface. Nat Commun 14, 6040
(2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-41721-9
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