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今天小编分享的是2025年1月1日由哈佛医学院团队在《Theranostics》发表题为“Inhibition of nitric oxide synthase transforms carotid occlusion-mediated benign oligemia into de novo large cerebral infarction”，基于基础和临床研究，通过孟德尔随机化（MR）研究一氧化氮合酶的抑制在缺血性中风风险中的因果作用。
·在900只小鼠中，研究腹腔注射/不注射NOS抑制剂（NOSi） n ω-硝基- l -精氨酸甲酯（L-NAME, 400 mg/kg）的UCAO的卒中相关效应。
·检测no供体molsidomine （200 mg/kg， 30分钟）的治疗效果。
·利用438 名 UCAO 中风患者的临床研究和一项关于内源性 NOSi的孟德尔随机化研究证实小鼠实验 （n = 900），从而调查了 NOS 抑制与人类缺血性中风风险之间存在的因果关系。
在C57BL/6小鼠中（图1A），单独UCAO很少诱发梗死（2%,1/47）：接受UCAO 24小时的37只小鼠中只有1只（3%）发生梗死，梗死面积较小，而接受UCAO 7天的10只小鼠中没有发生梗死（0%）。正如预期的那样，单纯L-NAME组（n = 12）和假手术组（n = 7）均未导致梗死。相比之下，UCAO联合预先单次腹腔注射L-NAME （L-NAME+UCAO）导致了大多数动物（74%,55/74）的梗死，如在第1、2、3或6天过早死亡（致死性梗死）或预先计划的牺牲后进行的TTC染色所示。死亡（100%,23/23）或处死（59%,19/32）后，大部分小鼠梗死灶体积较大。存活小鼠在上述时间点的梗死体积分别为（115±20）、（74±30）、（55±25）、（9±9）mm3。这种下降趋势反映了梗死面积较大的小鼠更有可能在计划的安乐死之前死亡。在BALB/c小鼠中，L-NAME+ ucao介导的重度（大面积或致死性）梗死发生率较高，而SV129小鼠的梗死发生率较低（图1A）。在接受L-NAME+UCAO的雌性C57BL/6小鼠中，68%（15/22）的小鼠在第1天发生了梗死，与前述雄性小鼠的69%（29/42）相比，差异无统计学意义（P = 0.94）。在死亡（100%,2/2）或牺牲（46%,6/13）后评估时，约一半雌性的梗死有大病变（53%,8/15）。
与UCAO前相比，UCAO后给予L-NAME可降低梗死发生率，缩小病变面积
在C57BL/6和BALB/c小鼠（n = 9/time-point/strain）中，与上述L-NAME+UCAO（牺牲1 d组）相比，在L-NAME给药前延长（5或7 d） UCAO，而不是缩短（3 h, 1-3 d） UCAO （UCAO+L-NAME）诱导了L-NAME给药后24小时的梗死频率减少约50%，并产生了约70%的小病变（图1B）。
如图1C所示，molsidomide处理的C57BL/6小鼠均未死亡（0%,0/22），而生理盐水处理的小鼠有10/22（46%）死亡。molsidomin处理的BALB/c小鼠（n = 22）有4只（18%）死亡，而生理盐水处理的小鼠（n = 22）有6只（27%）死亡。molsidomine治疗后，存活至处死的C57BL/6小鼠的平均±SE梗死体积显著低于生理盐水治疗组。在BALB/c小鼠中，molsidomine治疗相关的梗死体积有减少的趋势。
所有SI阳性小鼠均发生了严重（即大面积或致死性）梗死。SI通常开始于UCAO同侧半球的后外侧区域(图2)。10只大鼠平均±等效球镜下rCoBF值为26.7±5.2%。初始缺血灶逐渐扩大，通常向同侧半球的前内侧扩大，从而包围了同侧半球的大部分皮质。
在核心区（ROI-1），初始（L-NAME+UCAO后0 ~ 10 min和10 ~ 30 min），各组的LS均值rCoBF均高于30%，但SI（+）·Recovery（-）·梗死组的LS均值（~50%）显著低于SI（-）组(~75%；图2 d)。在30 ~ 330 min时，SI（+）组和SI（-）组的LS平均rCoBF值均显著低于SI（-）组和SI（+）组。在每个SI中，如图2D（显示最后的SI数据）的上方阴影区域所示，在两个SI（+）组中，rCoBF分别下降至约30%或更低，随后分别出现或未出现rCoBF恢复。因此，与SI（+）·Recovery（+）·infarct组相比，SI（+）·Recovery（-）·infarct组在330 ~ 360 min的LS均值（95% CI） rCoBF显著降低：分别为19.4%（6.5 ~ 32.4）和51.7%（41.2 ~ 62.3）。
监测了心率、血压和CoBF，以研究L-NAME给药和/或UCAO是否与血流动力学不稳定相关（图3）。两组之间的心率和体循环血压无显著差异，因此L-NAME+UCAO后体循环低灌注不太可能导致SI和梗死。
在血栓相关实验中（图4），在L-NAME+UCAO后（图4B）连续6 d使用纤维蛋白靶向金纳米颗粒（图4A）进行的体内高分辨率microCT成像直接显示血栓（图4），在C57BL/6 （n = 14）和BALB/c （n = 9）小鼠中未显示大动脉血栓形成的证据。L-NAME+UCAO（5只C57BL/6小鼠）后24 h获得的脑组织切片的he染色显示，小动脉和毛细血管微血栓，特别是在UCAO同侧的梗死半球（图4C）。此外，通过颅窗对同侧脑区的活体双光子显微镜成像（图5）(5只C57BL/6和18只BALB/c小鼠在L-NAME+UCAO后~4或~24小时连续进行；2只C57BL/6和5只BALB/c小鼠被排除补充材料)显示，实时的微血管血栓形成（图5C）和小动脉收缩（图5A-B）。如图4D所示，西洛他唑组的6 d卒中相关死亡率显著低于盐水组（P = 0.018， log-rank检验）：6 d卒中相关死亡率为50%（12/24）比88%（21/24）。氯吡格雷组（67%,16/24）和阿司匹林组（71%,17/24）的死亡率有低于盐水组的趋势（P = 0.074和0.077）。西洛他唑组严重（即大面积或致死性）梗死发生率最低（63%,15/24），其次为氯吡格雷组（71%,17/24）和阿司匹林组（83%,20/24），盐水组最高（88%,21/24）：西洛他唑组和盐水组卡方检验P = 0.046。此外，存活至6天的小鼠在梗死体积方面没有表现出显著的组间差异。
在168只（92只C57BL/6和76只ApoE-/-）小鼠中分析UCAO是否也在stz诱导的高血糖和hfd诱导的高脂血症后诱导小鼠梗死（图6A）。使用生理盐水或STZ UCAO后24 h的TTC染色（图6A）显示，任何C57BL/6小鼠（分别为0/6和0/8）或ApoE-/-小鼠（分别为0/10和0/11）均未发生梗死。C57BL/6（0/12）和ApoE-/-(0/9)小鼠UCAO后，HFD未引起心肌梗死。相比之下，STZ+HFD+UCAO在22%（11/49，包括3个致死梗死）的C57BL/6小鼠和31%（9/29）的ApoE-/-小鼠中诱导了UCAO后的大动脉梗死。大约一半的梗死动物（6/11 C57BL/6和4/9 ApoE-/-小鼠）有大面积梗死。在随后的实验中，在20只（10只HFD+STZ和10只溶剂对照）C57BL/6小鼠（无UCAO）中测定了两种内源性NOSi （ADMA和SDMA）的血液水平，以检测NOS抑制在高血糖高脂血症小鼠UCAO介导的梗死中的作用（图6B）。STZ+HFD组SDMA水平[(26.8±1.5)ng/mL]显著高于对照组[(17.1±1.2)ng/mL, P < 0.001]， ADMA水平则无明显变化。
为了获得高血糖和高脂血症引起的 NOS 功能障碍可能与人类颈动脉闭塞后梗死有关的原理证明，使用 DW-MRI 进行了一项多中心临床研究，以确定与 UCAO 引起的急性（< 7 d）脑梗死体积相关的因素（即症状性 UCAO）。连续招募了 438 名患者，其中 271 名为男性。多元线性回归分析（表1 中的模型 1）显示空腹血糖和总胆固醇水平以及初始卒中严重程度和心房颤动与梗死体积显著相关。此外，年龄往往与梗死体积相关 （P = 0.07）。进一步调整卒中亚型 （表 1 中的模型 2） 后，空腹血糖和初始卒中严重程度与梗死体积显著相关，而总胆固醇和年龄往往与梗死体积相关 。
为了进一步支持假设，即 NOS 缺陷将颈动脉闭塞转化为梗死，进行了孟德尔随机化分析：发现 SDMA 浓度对使用 IVW 方法的缺血性卒中风险有显著的因果影响 （图 7B）。相比之下，使用 IVW 方法无法推断 L-精氨酸或 ADMA 的显著因果关系。
这是第一个证明UCAO介导的良性少血症可以转化为大脑半球梗死的研究，当在UCAO之前或之后通过单剂量腹腔内注射NOSi （L-NAME）进行治疗时。这一转化与SI相关，SI是在病理条件下通过反向神经血管耦联扩散去极化介导的血管收缩。NO供体molsidomine的成功拯救证实了NO缺乏在导致SI和脑梗死发生发展中的重要性。我们还发现，在高血糖和高血脂的情况下，可能部分通过增加内源性NOSi SDMA，单独UCAO在C57BL/6小鼠和ApoE-/-小鼠中诱导的梗死发生率远高于naïve C57BL/6小鼠。与这一动物研究一致，随后的临床研究表明，高血糖或高血脂患者在急性颈动脉闭塞性卒中中梗死面积显著增大。最后，孟德尔随机化分析显示SDMA在人类缺血性卒中风险中起致病作用。未来的研究应进一步了解NOS抑制和/或NO缺乏在缺血性脑血管病风险和严重程度中的作用及其潜在机制。这样的工作可以使用我们在本研究中使用的新的动物模型进行活体成像和药物测试。
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