染色质携带了生物体绝大多数的遗传信息，因此染色质的复制和基因转录的精准调控对于生理功能的正常运行至关重要。核小体是染色质的基本单位，在DNA复制过程中，核小体与DNA的缠绕会被暂时打开，并在复制完成后迅速重建【1】。研究新复制的染色质中核小体解聚和重建动态有助于理解基因表达如何在细胞中建立和保持。现有的研究方法多是利用高通量测序【2,3】，对短读长测序数据进行群体平均化，无法揭示单个分子水平蛋白-DNA相互作用的连续性，限制了人们对染色质如何在新复制DNA上重建的理解。近日，来自美国加州大学旧金山分校的Vijay Ramani在Cell上发表了论文The single-molecule accessibility landscape of newly replicated mammalian chromatin。在本研究中，作者开发了一种新的基于PacBio测序平台的预测模型，能够在全基因组范围内观察新复制染色质上的蛋白-DNA相互作用，并提供单分子层面的信息。现有的一些计算方法可以在Oxford Nanopore Technologies（ONT）平台上检测BrdU标记的核苷酸【4】，但在PacBio测序平台尚未有相关报道。相较于ONT测序平台，PacBio具有更高的保真性和更准确的碱基修饰检测优势，因此更适合用于分析新合成DNA的动态。在该研究中，作者希望开发一种基于PacBio测序平台的预测模型，通过检测聚合酶的动力学，建立一个能够识别含有BrdU的DNA分子模型。他们通过使用包含dTTP或BrdUTP的PCR生成样本、小鼠基因组和人类基因组DNA样本，作为训练数据来训练卷积神经网络（CNN）模型，将其命名为RASAM。RASAM模型基于PacBio的核苷酸掺入动力学数据以及DNA序列的one-hot编码，在500个碱基对尺度上预测BrdU的掺入。利用这种方法，作者成功在单分子水平上准确检测BrdU的掺入，并用于分析染色质结构的动态变化。在不同的BrdU标记时间下，研究人员观察了人类K562细胞和小鼠胚胎干细胞（mESCs）中BrdU标记的染色质分子与未标记染色质分子的可及性变化。他们发现，新复制的染色质比稳态染色质具有更高的可及性，且这种可及性在较长时间内逐渐恢复到稳态水平。同时，新生染色质中的核小体保护DNA的长度较短，可能是因为这些核小体尚未完全包裹DNA。作者还利用RASAM技术探究了新生染色质的单分子核小体间距模式对染色质高可及性的影响。通过分析新生染色质上单分子核小体重复长度和排列规律性，作者发现不同时间标记的染色质包含不同类型的核小体纤维，并且在新生染色质中出现了特定的核小体排列类型，而新生染色质纤维倾向于具有较长重复长度和不规则排列的核小体阵列。与成熟染色质相比，新生染色质中核小体位置受到DNA主序列的影响更大，尤其是在不规则阵列的核小体纤维中。这种现象可能与染色质尚未经过染色质重塑及成熟过程有关。这些结果说明，复制后染色质的初始结构和排列不仅高度可及，而且可能受到DNA序列和核小体间距模式的影响。CAF-1是一种在DNA复制后染色质的重组和调控中发挥重要作用的组蛋白伴侣，研究发现在CAF-1缺失的条件下，新生染色质在15分钟和1小时标记时间点表现出更高的可及性。这表明CAF-1在某种程度上限制了新生染色质的高可及性，通过在复制后的染色质纤维上沉积核小体来调控染色质的结构。CAF-1缺失不仅影响新生染色质，也在全基因组范围内增加了稳态染色质的可及性，包括在活性和非活性顺式调控元件附近。这可能是由于CAF-1的缺失导致去新生核小体（H3-H4四聚体）沉积的减少，从而使更多DNA区域暴露。同时，CAF-1缺失显著减少了新生染色质中具有短重复长度和规则排列的核小体纤维类型，增加了不规则排列的核小体纤维。这表明CAF-1通过促进规则的核小体阵列形成来限制新生染色质的高可及性，而CAF-1缺失后染色质中更容易出现间隔不均的核小体排列。这些结果从分子层面上揭示了CAF-1如何影响染色质结构，尤其是在细胞分裂后的新生染色质重塑中的作用。目前为止，对于新生染色质中特定的顺式调控区域如何在细胞类型特异性的环境中实现调控特异性仍然未知。因此，作者打算继续利用开发的RASAM技术对此进行探究。研究发现，不同的调控序列在新生染色质中具有不同的单分子染色质重组动态。其中，CTCF结合位点在新生染色质中因核小体竞争表现出较低的可及性，表明CTCF与核小体争夺位点，需要较长时间才能恢复到稳态。而转录起始位点（TSS）则在复制后迅速恢复开放状态，显示出无核小体区域的快速重建。这表明，不同调控序列在新生染色质中的重组速度和方式不同，由此实现了特定的调控特异性。进一步的结合CTCF化学诱导降解实验，发现在诱导CTCF降解后，新生染色质中的CTCF结合位点表现出显著的高可及性，特别是在15分钟和1小时标记时间点。相较于未降解的CTCF样本，降解后的样本中CTCF位点的可及性大幅增加，表明CTCF的结合限制了新生染色质的高可及性。在DNA复制后，CTCF结合位点通过CTCF和新生核小体之间的竞争来恢复结构，从而指导核小体在染色质纤维上的正确排列。而当CTCF被降解后，核小体更容易重新占据这些位点，导致新生染色质的高可及性增加。总的来说，作者利用基于PacBio测序平台开发的RASAM技术发现与稳态染色质相比，新复制的染色质富含未包裹的、间距不规则的核小体类型，以及揭示了序列非特异性伴侣复合物和序列特异性转录因子在复制后重塑单分子核小体结构中的直接调控作用。https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.10.039制版人：十一
1. Ramachandran, S., Ahmad, K., and Henikoff, S. (2017). Capitalizing on disaster: establishing chromatin specificity behind the replication fork. BioEssays 39.
2. Worcel, A., Han, S., and Wong, M.L. (1978). Assembly of newly replicated chromatin. Cell 15, 969–977.
3. Annunziato, A.T., Schindler, R.K., Thomas, C.A., Jr., and Seale, R.L. (1981). Dual nature of newly replicated chromatin. Evidence for nucleosomal and non-nucleosomal DNA at the site of native replication forks. J. Biol. Chem. 256, 11880–11886.
4. Mu ̈ ller, C.A., Boemo, M.A., Spingardi, P., Kessler, B.M., Kriaucionis, S., Simpson, J.T., and Nieduszynski, C.A. (2019). Capturing the dynamics of genome replication on individual ultra-long nanopore sequence reads. Nat. Methods 16, 429–436.
BioART战略合作伙伴
（*排名不分先后）
转载须知
【原创文章】BioArt原创文章，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，所刊登的所有作品的著作权均为BioArt所拥有。BioArt保留所有法定权利，违者必究。
![]()
