RNAi和CRISPRi：脱靶效应低，数据可信度才高！

脱靶效应的存在会使RNAi和CRISPRi实验数据的解读变得非常复杂。Dharmacon™的ON-TARGETplus™siRNA和CRISPRmod CRISPRi技术设计用于以最小的脱靶效应敲除靶基因，是正交验证策略的强大工具，可产生高度特异性的结果。

为了验证这两种技术的特异性，我们通过靶向USOS细胞中的SEL1，对CRISPRmod CRISPRi和ON-TARGETplus试剂进行了脱靶特征基因表达分析。测量SEL1敲低的基因表达水平（log₂TPM，转录本/百万），并与各自的非靶向对照进行比较。

尽管这两种技术的作用方式存在差异，但我们的CRISPRi和RNAi试剂测试结果具有高度特异性，正如两种基因表达特征中的Pearson相关系数所示（图1）。

图1:CRISPRi和siRNA实验的基因表达数据对比

在稳定表达dCas9-SALL1-SDS3的U2OS细胞（左）或原始U2OS细胞（右）内转染靶向SEL1L的三个guide RNAs或四个siRNAs库（y轴），转染48小时后与转染非靶向guide RNAs或siRNAs的细胞（x轴）的基因表达水平（log₂TPM，转录本每百万）对比数据。R为Pearson相关系数，对除SEL1L外的所有基因的对数变换值（TPM+1）计算。调整后p值< 0.05和绝对对数倍变化>2的上调或下调基因分别标记为红色和蓝色。差异表达分析（DESeq）显示dCas9-SALL1-SDS3 CRISPRi系统和ON-TARGETplus siRNA都有最小的脱靶基因敲除效应。对靶基因10000 kb以内和脱靶guide RNA 1 kb以内的基因组序列的检查表明，观察到的差异表达不能用邻域效应或guide RNA的非特异性结合来解释。Gene expression levels (log₂TPM, Transcripts Per Million) in U2OS cells stably expressing dCas9-SALL1-SDS3 (left) or parental U2OS cells (right) 48 hours post-transfection of a pool of three guide RNAs or a pool of four siRNAs targeting SEL1L (y axis) compared to expression in cells transfected with non-targeting guide RNAs or siRNAs only (x axis). R is Pearson's correlation coefficient, calculated for log transformed values (TPM+1) on all genes except SEL1L. Up-regulated or down-regulated genes with an adjusted p-value < 0.05 and absolute log2 fold change >2 are marked as red and blue, respectively. Differential expression analysis (DESeq) shows minimal off-target gene knockdown with both the dCas9-SALL1-SDS3 CRISPRi system and ON-TARGETplus siRNA. Examination of genomic sequences within 10,000 kb of the target gene and within 1 kb of an off-target guide RNA alignment of up to 4 mismatches indicated the observed differential expression could not be explained by neighborhood effects or nonspecific binding of the guide RNA.

基于此，我们进行了DNA损伤反应试验，表明这两种方法也可以用于正交验证步骤。复制蛋白A （RPA）由RPA1、RPA2和RPA3亚基组成，被认为与单链DNA具有高结合亲和力，并在DNA损伤反应中发挥关键的调节功能^1,2（图2）。

图2:DNA损伤反应途径

双链断裂是由DNA损伤诱导剂引起的，或者是由代谢、重组和转位等多种细胞过程自发引起的。当DNA复制叉停止或接近模板DNA中的缺口时，也会产生双链断裂。围绕双链断裂的H2AX（核心组蛋白复合物的组成成分）被迅速磷酸化，通过DNA损伤信号网络诱导一系列反应，包括DNA修复、细胞周期阻滞和细胞凋亡。RPA复合体在DNA复制和同源重组修复结构中结合单链DNA。RPA敲低会破坏复制叉的稳定性，抑制同源重组修复，导致双链断裂的积累，从而磷酸化H2AX1。Double strand breaks arise as a result of DNA damaging agents or spontaneously as a result of a variety of cellular processes including metabolism, recombination and transposition. Double strand breaks are also created when DNA replication forks stall or approach a nick in template DNA. H2AX (a constituent of core histone complexes) surrounding double strand breaks are rapidly phosphorylated, inducing a set of responses through the DNA damage signaling network, including DNA repair, cell cycle arrest and apoptosis. The RPA complex binds single stranded DNA in both DNA replication and homologous recombination repair structures. RPA knockdown destabilizes replication forks and inhibits homologous recombination repair, resulting in an accumulation of double strand breaks and hence phosphorylated H2AX1.

正如预期的那样，RPA1和RPA2的敲低导致未修复的双链DNA断裂的累积，这可以通过磷酸化的H2AX水平（γ-h2AX）的增加来体现。两种基因修饰工具在各自野生型对照的比较中都显示了结果可信（图3）。

图3:DNA损伤反应试验

围绕双链断裂的H2AX（核心组蛋白复合物的一个组成部分）被迅速磷酸化，通过DNA损伤信号网络诱导一系列反应。对DNA损伤通路至关重要的蛋白质的敲除导致未修复的双链DNA断裂的积累和磷酸化H2AX的增加（γ-h2AX）。从先前的RNAi筛选结果使用CRISPRmod CRISPRi试剂进行正交验证。在hEF1α启动子下组成表达dCas9-SALL1-SDS3的U2OS细胞，使用DharmaFECT 4转染试剂，用50nM的混合sgRNAs或ON-TARGETplus SMARTpools （50nM）靶向RPA2、RPA1或RRM2，转染72小时后，将细胞固定，用抗磷酸化- h2ax抗体染色，并用Hoechst染色法鉴定细胞核。用细胞试剂盒进行DNA损伤反应试验。取重复板，分离总RNA， RT-qPCR检测相对基因表达。以GAPDH为看家基因，用<s:2>†<e:1>†Cq法计算各靶基因的相对表达量，并归一化为非靶向对照（NTC）。H2AX (a constituent of core histone complexes) surrounding double strand breaks are rapidly phosphorylated, inducing a set of responses through the DNA damage signaling network. The knockdown of proteins critical to the DNA damage pathway results in an accumulation of unrepaired double stranded DNA breaks and an increase in phosphorylated H2AX (γ-h2AX). Hits from a prior RNAi screen were orthogonally validated using CRISPRmod CRISPRi reagents. U2OS cells constitutively expressing dCas9-SALL1-SDS3 under the hEF1α promoter were transfected with pooled sgRNAs (50nM) or ON-TARGETplus SMARTpools (50nM) targeting RPA2, RPA1, or RRM2 using DharmaFECT 4 Transfection Reagent. 72 hours post-transfection the cells were fixed and stained with an antiphospho-H2AX antibody and Hoechst stain was used to identify nuclei. DNA Damage Response Assay was performed with a cellular kit. A duplicate plate was harvested, total RNA was isolated, and relative gene expression was measured using RT-qPCR. The relative expression for each target gene was calculated with the ∆∆Cq method using GAPDH as the housekeeping gene and normalized to a non-targeting control (NTC).

这些结果证实了靶向抑制DNA转录（CRISPRi）和mRNA翻译（RNAi）两种基因调节技术的特异性。功能蛋白的表达可以从多个角度下调，从而获得高置信度的数据集。

Dharmacon siRNA产品有如下特点：

• SMARTselection^TM 技术⸺高度特异性，确保沉默效率

使用SMARTselection™ 技术设计高质量siRNA，该技术涵盖一整套完整而严密的设计算法，针对每个基因投放效果最好的4条siRNA至最终的产品中。

• SMARTpool^TM技术⸺无需验证，保证至少75％靶基因沉默效率

通过SMARTpool^TM技术更好的模拟内源RNAi通路，将针对同一靶基因的4条siRNA混合成为一管试剂，保证更高效的基因沉默效率。同时，由于每条siRNA的浓度相对降低而减少了脱靶效应（off-target），增强实验数据的真实性。

• 双链修饰技术，有效减少off-target并进一步提升沉默效率

siRNA是双链结构，最主要的脱靶效应是由反义链中“seed region”活性引起的，此外，正义链也有可能引起脱靶。我们拥有专利的双链修饰技术，对正义链和反义链同时进行修饰，能够有效的减少脱靶效应90%以上，同时抑制miRNA-like作用，并能有效减少细胞的生长抑制，保证沉默效率的同时防止假阳性。

咨询更多horizon及Dharmacon相关内容，可以关注达科为生物城微信公众号。

关于达科为

北京达科为生物技术有限公司由深圳达科为公司于2008年投资创立。公司专注于生命科学科研试剂、仪器、耗材等科研用品的销售。代理自主品牌（达优）和国际知名生物技术品牌140余家（独家代理30余家，一级代理90余家），产品线涉及免疫学、细胞生物学、分子生物学试剂与耗材，在北京、上海，广州，深圳等一线城市以及省会城市都设立了运营中心和分公司，达科为生物一直坚持“至臻品质 至善服务”的经营理念，是国内领先的生物试剂及仪器供应商。

联系我们

达科为官网：www.bio-city.net