尽管对脊髓生理学和病理学的研究已经持续至少一个世纪，在慢性疼痛、脊髓损伤等脊髓相关的研究领域依然有很多难题亟待解决。在脊髓研究中，长久以来缺乏能够在活体上进行大范围功能观察的手段。近年来兴起的超声脑功能成像（fUS）为这样一种观察提供了可能。目前，已经有大量的研究将fUS技术应用于脑功能成像，众多的研究成果显示这一新技术在清醒活动小动物脑功能成像上的独特优势。而在脊髓研究领域，也开始有研究小组将这一技术应用到脊髓成像，包括小动物的脊髓功能性成像；小动物脊髓损伤位置的高分辨率血流成像。最近发表在Neuron杂志上的一项工作，更进一步将fUS在脊髓上的应用推进到临床，在手术过程中对病人的脊髓进行功能性成像。
到目前为止，fUS在脊髓上的应用还刚刚起步，期待不久的将来，这一技术能够为脊髓研究领域带来更多激动人心的研究成果。
一
硬膜外电刺激引起的脊髓血液动力学改变
doi: 10.3389/fneur.2019.00279
硬膜外电刺激被证实可以有效地缓解慢性疼痛以及帕金森病的症状，但其中原理还未被研究清楚。这篇工作是一项可行性的研究，首次将fUS技术应用于大鼠和猪的脊髓，来观察硬膜外电刺激引起的脊髓血液动力学改变。由于脊髓和大脑一样存在神经血管耦合，因此脊髓的血液动力学改变可间接地反应脊髓功能的改变。
硬膜外电刺激过程中大鼠脊髓的fUS成像显示，电刺激可稳定地引发脊髓大范围的血液动力学改变。
不同强度的硬膜外电刺激引发不同程度的脊髓血流量（SCBV）改变（下图D）。与同时记录的肌电（EMG）信号相比，fUS得到的SCBV信号具有更高的敏感性。下图C和D中，较弱的电刺激（40Hz 1.0V）没有引起EMG显著的改变，但可引起SCBV信号的显著增强。
图1. 不同强度的硬膜外电刺激引发的EMG及SCBV改变
fUS成像上划定ROI可进一步研究脊髓不同部位对硬膜外电刺激的响应情况。这里对各个ROI的SCBV曲线的多个参数进行分析，发现脊髓的rostral-dorsal区段对刺激的响应最强。
图2. 上，fUS脊髓成像上划定ROI；下，脊髓不同部位对硬膜外电刺激的响应。
二
fUS揭示正常及炎症下的脊髓伤害感受环路
doi: 10.1097/j.pain.0000000000002078
这篇2021年发表于Pain杂志的论文，进一步从更深入的角度探索了fUS技术在脊髓研究中的应用。这里使用麻醉的大鼠，在切除椎板暴露脊髓后，用fUS探头获取脊髓横断面及矢状面两个方向的图像。
已经知道伤害性和非伤害性刺激可引起脊髓背角不同片层神经元的激活，由于存在神经血管耦合，理论上这些脊髓神经元的激活可引起血液动力学的改变。这篇工作希望通过fUS脊髓成像确认这一现象并进一步利用功能成像观察不同条件下刺激引发的脊髓响应。
外周机械刺激引起的脊髓响应
这里首先采用一种自然的伤害性刺激，作用于大鼠后肢。下图A为矢状面的脊髓功能图像及该刺激的激活地图，图像显示这一伤害性刺激主要激活脊髓背角。同样的方式检测了自然非伤害性外周刺激，结果表明无论是伤害性刺激（C）还是非伤害性刺激（D）都引起背角区域脊髓血流量（SBV）的大幅度增加。
图3. fUS揭示自然的外周刺激引起的脊髓血液动力学改变。
外周电刺激引发的脊髓响应
为了研究不同的传入纤维激活引起的脊髓响应，研究人员又采用了不同强度的电刺激，已经知道0.5mA，1.5mA, 3mA刺激分别激活Ab，Ad和C纤维。下图C显示用不同强度电刺激激活不同纤维引起不同程度的脊髓血流量（SBV）改变，其中Ab纤维激活并不引起SBV改变，Ad和C纤维的激活都引起SBV增加，而这一增加可被抑制纤维活性的ketamine所抑制。此外，采用脊髓横断面成像观察到外周刺激引发的脊髓响应是同侧的，这与已有的研究结果一致。
图4. 外周电刺激引起的脊髓响应是纤维特异性的，并且是同侧的。
刺激外周不同部位引起脊髓不同位置的响应
理论上，外周不同部位的初级感觉传入纤维进入同侧的不同区段的脊髓背角，利用fUS，研究人员从功能成像的角度在活体动物上观察到了这一现象。下图中，A显示刺激L3，L4，L5皮区所激活的脊髓部位在矢状成像存在前后位置的差异。B，C，D图进一步显示不同皮区在脊髓上响应范围的空间位置。
图5. 脊髓血液动力学响应反映不同投射纤维进入背角的位置。
痛觉超敏动物模型的脊髓功能成像
接下来研究人员在一种痛觉超敏动物模型上进行脊髓功能成像。和正常动物相比，在痛觉超敏的动物上轻微的刺激（毛刷刷后脚掌）在脊髓中引起更强的SBV改变（下图）。
图6. 外周机械刺激在痛敏动物上引起更强的脊髓响应。
三
脊髓损伤后的血管重构
doi: 10.1038/s41598-022-10250-8
fUS成像的原理是通过检测血流来间接反映神经活动，因此利用同样的一套设备也可以进行活体血流成像，这一方法被称为超快多普勒成像（ultrafast Doppler imaging），尤其在结合临床使用的超声增强剂——微泡之后，可获得显微水平（<10mm）的血流成像，该技术被称为ultrasound localization microscopy（ULM）。这篇论文的工作就是利用这些方法，观察脊髓损伤后血管的修复过程。
急性脊髓损伤会引起严重的血管网络的损坏，自然修复过程伴随着新血管的形成。由于过往的相关研究通常局限于固定组织，因此损伤后新生血管的功能目前仍不清楚。研究人员利用超快多普勒成像和ULM这两个方法，分别从宏观和微观的尺度研究了脊髓损伤后脊髓血管的结构和功能。
损伤部位脊髓血流量减少
利用超快多普勒成像检测脊髓损伤4周及8周后动物脊髓的血流量（SBV），结果显示和对照动物相比，脊髓损伤动物在损伤处的血流量明显减少。
图7. 脊髓损伤部位相比对照血流量显著减少。
脊髓损伤部位血管结构和血流速度异常
接下来研究人员经动物颈静脉注射微泡，利用ULM功能在更微观的水平研究脊髓损伤部位的血管功能。下图B，ULM获得的正常小鼠和损伤小鼠的脊髓矢状血管图像。利用这个图像，首先分析了血管分布密度。下图C为不同部位脊髓血管分布密度的分析结果，损伤后4周及8周动物的脊髓损伤部位血管分布密度显著减小。此外更细致地分析脊髓上的三种血管（CSA，ASA，dorsal vein），发现CSA在脊髓受损情况下分布显著减少，而ASA和dorsal vein在损伤后没有显著改变。其次，分析了脊髓血管的弯曲度，下图D可见损伤后血管弯曲度显著增加。
图8. ULM图像揭示脊髓损伤后血管分布密度及弯曲度的改变。
ULM获得的图像除了包含血管结构的信息也包含血流动力学信息。对血流速度的定量分析揭示脊髓损伤也显著地影响脊髓血流的速度，并且其影响并不局限于损伤部位，而是波及损伤以外的脊髓段。
图9. 对ULM血流速度图的定量分析结果。
四
人类脊髓的功能成像
Doi: 10.1101/2022.08.06.503044
这篇去年发表于预印本期刊的论文首次将fUS技术应用于术中病人的脊髓功能成像。这些病人需要通过手术在脊髓处安装硬膜外刺激（ESCS）设备以缓解慢性的背部疼痛，在手术过程中研究人员利用fUS探头扫描硬膜下的脊髓，观察硬膜外刺激引起的脊髓反应。这些实验结果首次证实fUS技术可以在人体上检测到外部刺激引起的脊髓血流量改变。
图10. 手术中进行fUS脊髓功能成像的场景
图11. A绿色方框为fUS成像区域，B实际得到的脊髓功能图像。
单次硬膜外刺激引起的脊髓响应，红色表示信号相对基线增强，蓝色表示信号相对基线减弱。
接下来研究人员进一步对四个病人的脊髓功能成像进行定量的分析。下图A显示四个病人脊髓功能图像上受到硬膜外电刺激强烈影响的区域。B，C图为各个病人功能图像上，特定区域的脊髓功能信号曲线图， 可以看出存在在ESCS后信号增强的区域，也有减弱的区域。虽然目前条件下很难在不同病人上采集到位置完全一致的脊髓图像，但从这批实验结果看，总得来说这四个病人的脊髓响应情况具有较好的一致性。
图12. 四个病人上ESCS刺激实验的统计分析。
近几年发表的这几篇动物研究和临床研究的工作是fUS技术（包括其衍生的血流成像技术）在脊髓研究领域的初步尝试。这些研究结果体现了该技术在脊髓功能观察和脊髓血流观察上的可行性和优势：相较于离体电生理、免疫组化等方法能够提供活体的动态的观察视角；相较于活体电生理，具有更大的观察视野；相较于fMRI等功能成像技术，具有更好的空间分辨率，并且更易于和电生理等其它技术结合进行观察。
ICONEUS ONE
上图是fUS的商业化产品ICONEUS ONE，已在全球60多个大学、研究所落地，并已发表过百篇文章。礼智生物科技是ICONEUS在中国地区的总经销商，致力于fUS技术的推广和开发。
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