如何从fUS技术开始你的脑科学探索

引

言

fUS是近几年发展迅速的一种新型脑功能成像技术，在我们往期的文章中已经介绍了fUS在清醒小动物脑功能成像上的优越性（fUS技术专题（一）：自由活动动物深部功能性脑成像的新方法），包括高信噪比，高时空分辨率，高兼容性，尤其是该技术在清醒活动动物上的独特优势使得小动物脑功能成像的应用范围得到很大的拓宽。同时，由于fUS的这些特点，脑功能成像也越来越多地融入神经科学研究的前沿领域，包括神经环路研究，神经精神疾病研究等等，并和很多经典的研究手段相结合，如光遗传、在体钙成像、在体电生理等。fUS脑功能成像技术带来的宏观视野与经典方法的精微操控和观测相互结合能够碰撞出怎样精彩的科学发现呢？我们又应该如何利用好fUS这个工具去回答科学问题？最近发表的两篇重量级论文提供非常有参考意义的实例，值得我们学习借鉴。

其中一篇是丹扬院士团队今年12月刚发表在Cell的文章，另一篇是国内首篇用到fUS技术的工作，今年十一月发表于高分杂志Advanced Science上。这两篇工作都是始于fUS实验，通过对小鼠大脑的大范围扫描，找到目标脑区，后续的研究都围绕这个脑区展开。由此可以看出，fUS可以成为一个前期筛选的工具，结合多种干预方式，例如Cell文章中的光遗传刺激，或者Advanced Science文章中的药物干预，通过大范围扫描筛选出关键性的脑区，为后续的研究指明方向。

睡眠期间，意识知觉会大幅度减弱，但到目前为止其中的神经环路机制尚不为人所知。2023年12月8日，美国科学院院士、加州大学伯克利分校的丹扬教授在Cell杂志发表了题为：Circuit mechanism for suppression of frontal cortical ignition during NREM sleep 的研究论文。这篇论文首次揭示了在NREM睡眠期间视觉皮层到前额叶皮层的信号传递受到抑制的机制。

这一重要的工作始于fUS与光遗传相结合的一个关键实验。作者在小鼠视觉皮层V1区注射病毒，使得该脑区的神经元表达红光激活的光敏蛋白ReaChR，并在V1区引入光纤，在光刺激的同时对头部固定的清醒小鼠进行大范围的fUS扫描。

图1. 利用fUS技术获得V1区光遗传刺激的全脑激活地图。

图1. A为这一实验的示意图，fUS探头对小鼠进行矢状面扫描，由于fUS技术具有非常好的电磁兼容性，并且扫描时探头与动物头部可保持一定的距离，因此允许植入EEG电极和光遗传光纤，可在扫描的同时记录电生理信号并给以光遗传刺激。fUS探头固定于电机，通过电机的移动可获得多个矢状面成像，最终获得全脑的三维脑功成像。图1.B，D图分别显示单个矢状面以及三维大脑中被光遗传刺激激活的区域，激活脑区总结于E图，可以清楚地看到除了V1区本身的激活，还有RSP（retrosplenial cortex)，ACA（anterior cingulate area），TH（thalamus），SC（superior colliculus）等皮层及皮层下脑区激活。

图2. 睡眠周期中的fus（CBV）信号。

接下来，研究人员将睡眠的检测结合进来。通过同时性的EEG和EMG记录发现在fUS记录过程中动物也存在正常的睡眠-觉醒周期。全脑的fUS（CBV）信号在REM睡眠期间显著地增加（这与2018年发表于nature communications上的结果一致），但在NREM睡眠期间全脑fUS（CBV）信号相对于觉醒时期没有显著改变。

图3. 觉醒期和NREM睡眠期，各脑区fUS信号对V1区光遗传激活的响应。

然而，在觉醒期和NREM睡眠期，V1期光遗传激活引起的fUS信号响应在部分脑区出现了差异。其中，差异最显著的是ACA脑区（图3），在NREM睡眠期，V1区激活引起的ACA响应受到了大幅抑制。

至此，利用fUS找到了觉醒到睡眠过程中，感知觉减弱的关键性脑区，后续的研究围绕ACA脑区，采用钙成像，化学遗传学等方法，更深入地研究这一神经环路涉及的细胞亚型，发现来源于基底前脑的胆碱能神经元参与调控了睡眠觉醒过程中感觉信号在皮层传递的。

图4. 化学遗传学抑制基底前脑胆碱能神经元对V1区到ACA区神经活动传递的影响。

为了验证基底前脑胆碱能神经元的作用，作者还使用了fUS技术还和化学遗传学结合的研究方法。当用化学遗传学方法抑制基底前脑胆碱能神经元，清醒状态下V1区光遗传激活引起的ACA激活也被抑制了（图4）。而用化学遗传学方法激活基底前脑胆碱能神经元，NREM睡眠期V1到ACA的神经激活传递依然存在（图5）。并且，这一结果被ACA区锥体神经元钙信号所验证（图4，5）。

图5. 化学遗传学激活基底前脑胆碱能神经元对V1区到ACA区神经活动传递的影响。

今年我们很高兴地迎来国内fUS相关的第一篇论文。这篇论文研究不伴有听力受损的耳鸣的脑机制。已经知道不伴有听力受损的耳鸣患者更多地出现心理和情绪障碍，并且耳鸣与大脑边缘系统的异常代谢有密切关联，但其中的分子机制尚不清楚。

为了找到与耳鸣症状最相关的脑区，研究人员首先利用fUS技术对小鼠大脑进行大范围的筛选。这里用到了一种稳定且迅速的耳鸣造模方法，即单次注射水杨酸盐（salicylate）。

图6. 注射水杨酸盐对小鼠各脑区fUS（CBV）信号的影响。

在记录20分钟基线后注射水杨酸盐，部分脑区出现CBV信号的增强，包括ACC（anterior cingulate cortex），dorsal thalamus等区域。其中增强最为显著的是ACC，推测边缘系统中的这个脑区是耳鸣症状形成中的关键脑区。

论文后续针对ACC脑区采用代谢组学，磷酸化蛋白组学等分子手段深入研究了该脑区在耳鸣形成中的分子机制，并得到结论，ACC脑区通过与初级听觉皮层的相互作用在耳鸣的形成中起到关键作用，并为未来的药物研发提供了分子靶标。

 总

结

近期发表的这两篇论文虽然研究方向差异很大，一篇是神经环路研究，一篇是疾病研究，但都得益于fUS技术适合进行清醒动物全脑大范围观察的优势，结合特定的干预手段，包括光遗传和给药，筛选出变化最显著的脑区，并以此作为后续研究的核心。

fUS技术最早是源于巴黎高等物理化工学院（ESPCI Paris）Mickeal Tanter教授团队的研究。值得一提的是ESPCI Pairs是很多现代重要技术的起源地，尤其在超声技术领域拥有极强的科研背景。1881年诺贝尔奖获得者皮埃尔居里正是在这里发现了反压电效应，后来成为现代超声技术的基石。Tanter教授及其同事带领的团队在2016年成立了ICONEUS公司，致力于fUS技术的持续开发与商业化。

ICONEUS作为fUS技术的发明人和关键专利拥有者，目前全球60多个大学、科研院已成为其用户，发表上百篇包括CNS在内的文章，国内也已有10几个单位采购。其多样化的探头和成熟的软硬件系统，可以帮助神经科学工作者，快速获得想要的数据，并有大量已发表的文献作为背书。

礼智生物科技已在国内代理ICONEUS设备，并开发fUS技术的手术及实验超过4年时间，积累了丰富的手术和实验技术，将为使用ICONEUS的实验室提供全面的支持。以下是在我们的demo机上获得的小鼠fUS图像：

图7. 小鼠大脑冠状面的fUS脑功能图像。

图8. 小鼠小脑及脑干的fUS脑功图像。

我们在脑损伤的小鼠上观察到完整的癫痫发作，癫痫始于皮层并迅速波及深部脑区。

视频2. 小鼠左右脑分别记录到一次完整的癫痫发作，红色代表fUS信号增强，蓝色代表信号减弱。

目前清华大学新建成的fUS成像平台正在招聘管理人员，有意者详见招聘链接：

清华大学生物医学影像中心招聘启事