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前几天分享了一篇棕榈酰化的文章，我发现对这个方向感兴趣的小伙们还真是不少。近日，山大齐鲁医院团队在Science子刊（Science immunology）发表了一篇棕榈酰化方向的研究。研究通过揭示TIM-3棕榈酰化的新机制、DHHC9在免疫逃逸中的作用为癌症免疫治疗提供了新的策略和理论基础。
我大胆预测，棕榈酰化不久的将来将跟乳酸化一样火。课题方向还没确定的宝子可以考虑一下这个方向哦~精巧的研究角度有时候比闷着头的研究更能解决问题！如果你一时间想不出好的研究切入点，可以紧联我，每个人的需求都是独一无二的，我们为您量身定制，让每一步都精准有力。
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题目：TIM-3的棕榈酰化促进免疫衰竭并抑制抗肿瘤免疫
杂志：Sci Immunol （IF 17.6）
发表时间：2024.11.15
研究背景
T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域蛋白3 （TIM-3）是一个免疫检查点，在免疫衰竭中起关键作用。然而，关于调节TIM-3表面表达和转换的机制知之甚少。本文研究了TIM-3的表面表达是如何被翻译后调控的。
研究结果
人TIM-3的胞质11-aa尾控制其表面表达和蛋白稳定性
与小鼠Tim-3相比，人类TIM-3在细胞质尾部增加了11个氨基酸残基（291 ~ 301），这11个氨基酸残基仅在灵长类动物TIM-3中发现，且序列保守。
通过亚细胞分离和免疫印迹分析人和小鼠TIM-3的分布。与主要定位在细胞膜(M)上的全长TIM-3 （TIM-3-fl）相比，超过一半的TIM-3Δ11aa存在于细胞器(O)部分。免疫荧光定位显示TIM-3-FL主要定位于细胞膜，而TIM-3Δ11aa主要与内质网标记物Sec61b结合，而与高尔基体标记物GalT或细胞膜蛋白NTCP不结合。此外，将人TIM-3的11-aa片段引入小鼠TIM-3的胞浆尾部（TIM-3 + 11-aa）增加了其在细胞膜上的分布，延长了其半衰期。总之，这些发现表明，人类TIM-3的细胞质11-aa尾部在决定其表面表达和稳定性方面起着至关重要的作用。
人TIM-3在Cys296位点的棕榈酰化对其表面表达和稳定性至关重要
为了实验验证TIM-3的棕榈酰化，作者对表达血凝素(HA) - TIM-3的HEK293T细胞进行酰基生物素交换（ABE）实验。用链亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）检测TIM-3的棕榈酰化，然后用抗HA珠免疫沉淀。当位置296的Cys残基被丙氨酸（C296A）取代时，人TIM-3蛋白的棕榈酰化被消除。这些发现表明TIM-3被棕榈酰化，而位于296位的Cys残基对TIM-3棕榈酰化至关重要。
免疫印迹显示，2-BP（溴十酸）处理降低了NK细胞系NK-92膜组分中TIM-3的表达。根据数据显示，C296A破坏了TIM-3棕榈酰化，TIM-3 - C296A突变体的蛋白水平低于野生型（WT），并且这种降低主要发生在膜组分。此外，转染和共聚焦成像显示TIM-3-WT主要在细胞表面表达，与ER标记物Sec61b的染色较少；相比之下，TIM-3-C296A在HeLa细胞中大部分定位于内质网。
接下来，作者旨在验证棕榈酰化引起的表面TIM-3的稳定表达。评估了棕榈酰化抑制剂2-BP在人免疫细胞（包括NK细胞系NK-92、巨噬细胞系THP-1和从外周血单核细胞（PBMCs）分离的原代CD8+ T细胞）中改变的亚细胞TIM-3表达。
TIM-3的棕榈酰化减弱了其与HRD1的相互作用和随后的ER相关降解
由于去棕榈酰化降低了TIM-3蛋白的稳定性，作者进一步探讨了TIM-3蛋白在棕榈酰化缺乏的情况下是如何降解的。蛋白酶体抑制剂MG132在HEK293T细胞和NK-92细胞中明显阻断了2-BP诱导的TIM-3降解，而溶酶体抑制剂氯喹（CQ）则没有这样。此外，抗泛素（Ub）免疫印迹显示TIM-3被多泛素化，并且在2- BP处理的NK-92细胞和过表达TIM-3的HEK293T细胞中，TIM-3的泛素化水平显著升高。同样，TIM-3-C296A突变体的多泛素化程度高于TIM-3-WT。这些数据表明C296棕榈酰化可以阻止TIM-3的泛素蛋白酶体降解。
保留在内质网中的错误折叠蛋白被转运到细胞质中进行蛋白酶体降解，这一过程被称为内质网相关蛋白降解（ERAD）。作者想知道TIM-3的降解是否是ERAD途径的结果。ERAD抑制剂eyarestatin I （EerI）损伤了2-BP诱导的NK-92细胞和过表达TIM-3的HEK293T细胞中TIM-3的降解。共免疫沉淀（Co-IP）显示，在HA-TIM-3和Flag-HRD1共转染的HEK293T细胞中，只有Flag-HRD1与HA-TIM-3共免疫沉淀，反之亦然。通过Co-IP分析，在NK-92细胞中证实了内源性TIM-3与HRD1的相互作用。此外，NK-92细胞中TIM-3-HRD1的相互作用在2-BP处理后增强。与TIM-3 -WT相比，C296A突变丢失了棕榈酰化C296位点，导致TIM-3与HRD1的结合增加。进一步的泛素化实验表明，在泛素存在的情况下，HRD1过表达增加了TIM-3的泛素化。与K48-而非k63-连接的多泛素链导致蛋白酶体降解的观点一致，HRD1促进的TIM-3多泛素化在K48R而非K63R泛素突变体存在下减少。这些数据表明TIM-3棕榈酰化抑制了其与HRD1的相互作用以及随后的k48多泛素化和降解。
TIM-3被DHHC9棕榈酰化，从而阻断其与HRD1的相互作用和泛素化降解
为了确定TIM-3棕榈酰化的主要棕榈酰转移酶，作者克隆了所有人类DHHC成员，并初步研究了它们与TIM-3的相互作用。6种棕榈酰转移酶（DHHC1、DHHC4、DHHC5、DHHC9、DHHC16和DHHC23）与TIM-3共免疫沉淀。接下来，用siRNA沉默这些酶，发现敲低DHHC9可降低TIM-3过表达HEK293T细胞中TIM-3蛋白的表达。Co-IP实验证实了NK-92细胞中内源性TIM-3与DHHC9的相互作用，共聚焦分析证实了TIM-3与DHHC9的共定位。此外，DHHC9敲低在很大程度上降低了TIM-3的棕榈酰化。DHHC9过表达不能增加TIM-3-C296A的棕榈酰化。因此，DHHC9与TIM-3在C296位点相互作用并棕榈酰化。
接下来，评估了DHHC9介导的棕榈酰化在HRD1介导的TIM-3蛋白降解中的作用。在NK-92细胞和人原代CD8+ T细胞中，DHHC9过表达导致内源性和表面TIM-3表达增加，而DHHC9敲低导致TIM-3表达减少。DHHC9的沉默也增加了NK-92细胞中内源性TIM-3的多泛素化，降低了其蛋白稳定性。此外，DHHC9的沉默促进了TIM-3与NK-92细胞中TIM-3 ERAD的E3连接酶HRD1的相互作用。同时，DHHC9敲低诱导的TIM-3多泛素化在HRD1沉默后受损。综上所述，上述数据表明DHHC9介导的棕榈酰化抑制了TIM-3与HRD1的相互作用，导致TIM-3蛋白泛素化降低，稳定性提高。
DHHC9参与肿瘤微环境中TIM-3表达增强和免疫衰竭
为了探讨DHHC9是否有助于TI淋巴细胞中TIM-3的表达升高，作者分析了TIM-3与DHHC9在HCC患者癌组织中CD8+ T细胞和CD56+ NK细胞上的相关性。TIM-3和DHHC9在TI-CD8 + T细胞和TI-NK细胞中共表达。DHHC9+ CD8+细胞和DHHC9+ CD56+细胞在HCC组织中的比例明显高于癌旁组织。TIM-3+细胞在DHHC9+ CD8+ T细胞和DHHC9+ CD56+ NK细胞群中比在DHHC9 -细胞群中更常见。由此可见，HCC组织中CD8+和CD56+细胞中DHHC9表达与TIM-3表达显著相关。此外，在TI-CD8 + T细胞和TI-CD56 + NK细胞中，DHHC9的高表达（DHHC9hi）与TIM-3高的HCC患者较短的生存期显著相关，而与TIM-3低的HCC患者无显著相关。
为了进一步证实DHHC9在TIM -3介导的免疫抑制中的作用，用表达CD19的Namalwa肿瘤细胞反复刺激CD19 CAR-T细胞，以诱导CAR-T细胞衰竭。CD19再刺激逐渐增加了TIM-3在CD19 CAR-T细胞中的表达水平。DHHC9沉默损害了TIM-3蛋白的增加，但没有影响HAVCR2的转录。此外，DHHC9敲低显著降低了三轮再刺激后诱导的CD8+ TEX （PD-1+TIM-3+TOX+TCF1−）细胞的频率。同时，含有shDHHC9的CD8+ CAR-T细胞产生更高量的干扰素-γ (IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和穿孔素，对Namalwa细胞的杀伤活性比对照CAR-T细胞强。
抑制DHHC9驱动的TIM-3棕榈酰化促进TIM-3降解
首先利用Schrödinger软件对TIM-3-DHHC9进行蛋白-蛋白对接研究，提取最佳构象进行分子结构分析。TIM-3的11-aa尾部与埋没的DHHC口袋具有很高的结合亲和力，TIM-3的Cys296可以与DHHC9的His167和Cys169形成关键的双氢键。接下来，将Cys296突变为丙氨酸，并通过250 ns长的时间尺度分子动力学模拟分析了11-aa尾部与DHHC9的结合模式。WT 11-aa尾部与DHHC9具有一致性结合；然而，在动态模拟的后期，C296A突变体逐渐与口袋分离。进一步的Co-IP实验证实单个C296A突变导致TIM-3-DHHC9相互作用明显减少。合成了含有TIM-3的11-aa尾部的生物素标记肽（biotin-TIM-3-11-aa）。下拉实验显示，DHHC9被生物素-TIM-3-11-aa-WT肽下拉，而不被生物素标记的C296A突变的11-aa尾部（生物素-TIM-3-11-aa-C296A）或未标记的TIM-3-11-aa-WT肽下拉。这些数据表明DHHC9以棕榈酰化位点cys296依赖的方式特异性地与TIM-3的11-aa尾部相互作用。
竞争性抑制剂的使用是选择性靶向DHHC乙酰转移酶活性的有效方法。因此，合成了一种含有11-aa尾部的细胞穿透肽融合的TIM-3（289-301）肽，称为TIM-3–Palm-WT，以阻断TIM-3与DHHC9的相互作用。合成含有C296A突变（TIM-3-Palm-Mut）的肽作为阴性对照。数据表明，TIM-3–Palm-WT肽特异性地干扰TIM-3与DHHC9的相互作用。
进一步研究发现TIM-3–Palm-WT肽抑制DHHC9调节的TIM-3棕榈酰化有效地触发了TIM-3的降解。
TIM-3棕榈酰化的肽抑制剂在体外和体内增强抗肿瘤免疫
为了检测DHHC9调控的TIM-3棕榈酰化在抗肿瘤免疫治疗中的潜力，用TIM-3 - palm - wt肽和TIM-3 - palm - mut作为对照处理NK-92细胞和CAR-T细胞。与TIM-3-Palm-Mut相比，TIM-3-Palm-WT处理显著增强了NK-92细胞对K562细胞和CD19 CAR-T细胞对Namalwa细胞的细胞毒能力。TIM-3-Palm-WT还增强了NK-92细胞和CD19 CAR-T细胞中IFN-γ、TNF-α和颗粒酶B的产生。此外，在再刺激诱导的CAR-T细胞衰竭模型中，TIM-3-Palm-WT处理显著降低了CD8+ TEX细胞的频率，并增加了IFN-γ、TNF-α和穿孔素的产生。
为了进一步评估TIM-3-Palm-WT肽在体内的免疫治疗潜力，作者在NCG小鼠中使用表达荧光素酶的HepG2细胞（HepG2- luc）建立了人肝癌模型。然后用经TIM-3-Palm-WT或TIM-3-Palm-Mut肽预处理的NK-92细胞处理这些小鼠。NK-92细胞的转移显著抑制了腹膜肝癌异种移植物的生长，当小鼠接受tim -3 - palm - wt处理的NK-92细胞时，这种作用进一步增强，而TIM-3-Palm-Mut处理的效果与NK-92细胞相当。为了进一步验证TIM-3-Palm-WT在增强CD8+ T细胞介导的抗肿瘤免疫中的作用，通过皮下注射荧光素酶转导的Namalwa （Namalwa- luc）细胞制备的异种移植物，将CD19 CAR-T细胞过继转移到NCG小鼠体内。CD19 CAR-T细胞有效地控制肿瘤生长并延长总体生存期，当CD19 CAR-T细胞用TIM-3-Palm-WT而不是TIM-3-Palm-Mut肽预处理时，这些效果更为明显。这些发现强调了通过设计TIM-3 - palm肽靶向TIM-3棕榈酰化进行抗肿瘤免疫治疗的治疗潜力。
局限性分析
1）没有描述棕榈酰化如何阻止TIM-3与HRD1结合。
2）虽然我们在TI-NK细胞和TI-CD8 + T细胞中观察到DHHC9的高表达水平，但在肿瘤免疫微环境中DHHC9上调的机制尚不清楚。
文章小结
研究发现DHHC9在Cys296位点催化的TIM-3特异性棕榈酰化可作为TIM-3质量控制器，促进其持续的表面表达。设计的TIM-3-Palm肽有效降低了TIM-3的表面表达，提高了肿瘤过继细胞治疗的效率。
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