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通讯作者：黄振烈 教授
通讯单位：南方医科大学
https://doi.org/10.1021/acsnano.4c03874• 使用肠上皮细胞特异性Nrf2敲除小鼠进行实验，为聚苯乙烯纳米塑料（PS-NPs）诱导神经毒性的肠脑轴调控机制提供直接证据。
• 阐明PS-NPs暴露诱导肠道菌群失调和IL-17C增加进而导致神经毒性的详细机制。• 提出保持肠道健康对于减轻纳米塑料神经毒性的重要作用。
该研究在肠上皮细胞特异性Nrf2缺陷的小鼠上使用微纳塑料环境相关浓度2.5 mg/kg和250 mg/kg聚苯乙烯纳米塑料（PS-NPs，50 nm）进行为期28天的重复剂量经口暴露毒性研究。结果显示，纳米塑料的暴露导致小鼠肠道微生物群失调，表现为肺炎支原体和放线菌科的增殖，进而导致肠道中白细胞介素17C（IL-17C）产量的增加；增加的IL-17C通过血液进入大脑，引发炎症和脑损伤。该研究揭示了肠道与神经系统健康之间的直接关联；特别是在纳米塑料暴露的背景下，肠道Nrf2特异性敲除的肠道脆弱小鼠表现出更严重的神经毒性。这种现象归因于这些小鼠肠道中与IL-17C生成相关的微生物群（如根瘤菌和洛夫氏菌）在纳米塑料刺激下的显著增加。研究还发现，通过体内使用抗IL-17C中和抗体或抗生素可以缓解神经毒性（图1）。该研究结果加深了对肠脑轴在纳米塑料诱导神经毒性中的调控机制的理解，并强调保持肠道健康对减轻纳米塑料神经毒性效应的重要性。![]()
作者此前研究发现纳米塑料（NPs）通过活性氧（ROS）介导的小鼠上皮细胞凋亡诱导肠道屏障功能障碍，促进其转运到包括大脑在内的各个身体区室。基于这些发现，进一步揭示NPs对小鼠的神经毒性。然而，NPs是否直接或间接引起神经毒性作用仍然存在不确定性。考虑到“微生物-肠-脑轴”在连接肠道健康与神经系统结果方面的关键作用，我们合理地推测：NPs不仅通过直接相互作用，还通过“微生物-肠-脑轴”的间接相互作用发挥其对神经系统损伤作用。
作者首先探讨了探讨肠道上皮细胞特异性Nrf2缺失是否会放大PS-NPs暴露引起的帕金森（PD）样神经损伤，通过旷场、握力和转杆疲劳实验测量了小鼠的运动能力、行走距离、握力、协调力和平衡力。研究结果显示，在暴露于PS-NPs后，肠道上皮细胞特异性Nrf2缺陷小鼠的运动活力降低，而在野生型小鼠中不存在这种影响（图2A-C）。暴露于PS-NPs后，两种基因型小鼠的握力减弱，在肠道上皮细胞特异性Nrf2缺陷小鼠中观察到更明显的降低（图2D）。此外，在肠道上皮细胞特异性Nrf2缺陷小鼠中，PS-NPs剂量依赖性地缩短了小鼠在转杆上停留的时间，却没有影响野生型小鼠在转杆上停留的时间（图2E）。![]()
图2 PS-NPs暴露28天对小鼠神经行为学的影响。随后，利用苏木精和伊红（HE）、Nissl和酪氨酸羟化酶（TH）染色评估中脑黑质致密区和纹状体的组织病理学变化，并通过免疫荧光评估PD的标志物p-α-突触核蛋白（p-αSYN）的表达。HE染色结果显示，两种基因型小鼠暴露于PS-NPs 28天后，中脑黑质致密区和纹状体均没有明显的病理变化（图3）。Nissl染色显示，肠道上皮细胞特异性Nrf2缺失小鼠中脑黑质致密区和纹状体的Nissl小体减少更为明显（图4）。TH染色显示，在肠道上皮细胞特异性Nrf2缺失小鼠的中脑黑质致密区和纹状体中观察到TH阳性细胞数量呈现剂量依赖性下降，而在野生型小鼠中则没有下降（图5）。在两种基因型的中脑黑质致密区或纹状体均未发现p-α-突触核蛋白错误折叠的积累（图5）。这些结果表明PS-NPs暴露引起的小鼠多巴胺能神经元的损失主要不是由p-α-突触核蛋白错误折叠引起的。图3 小鼠中脑黑质区HE染色代表图。黑色刻度条代表200 μm。
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图4 小鼠中脑黑质区Nissl染色代表图及其定量结果。黑色刻度条代表200 μm。![]()
图5 （A）小鼠中脑黑质区和（B）纹状体TH和p-α-synuclein染色代表图（C-F）及其定量结果。白色刻度条代表1 mm，黄色刻度条代表250 μm。接下来，作者还使用了透射电镜（TEM）检查小鼠中脑黑质致密区的线粒体超微结构。观察到肠上皮特异性Nrf2缺失小鼠中脑黑质致密区中嵴密度降低，线粒体增加，基质密度低，嵴扭曲，而在野生型小鼠中则没有发现这种情况（图6）。综上所述，本研究的研究结果表明肠道上皮细胞中Nrf2的缺失会加剧PS-NPs诱导的小鼠PD样神经毒性作用。![]()
图6 小鼠中脑TEM代表性图像，红色箭头指示线粒体。为了阐明PS-NPs在肠道上皮细胞特异性Nrf2缺陷小鼠中诱导更明显的神经毒性的原因，作者利用荧光标记的PS-NPs来研究它们在两种基因型之间生物分布的差异。荧光成像显示，暴露于2.5 mg/kg或250 mg/kg的PS-NPs 28天后，两种基因型的PS-NPs在小鼠大脑中广泛分布，包括皮层、海马、中脑黑质致密区和纹状体（图7A、B）。但在相同剂量浓度下，两种基因型小鼠大脑中PS-NPs的生物分布没有显著差异，从而排除了靶器官浓度差异导致两种基因型神经毒性差异的可能性（图7A、B）。另外，PS-NPs在两种基因型小鼠的肠道中的生物分布也没有显著差异（图7C-F）。![]()
图7 暴露28天后PS-NPs在（A）纹状体、（B）皮层、海马体和中脑切片中的生物分布。（C-F）PS-NPs在肠道中的生物分布。红色：PS-NPs，蓝色：DAPI。白色比例尺代表1 mm。随后，作者通过对空肠的RNA-seq分析，对不同mRNA表达谱进行了详尽的研究。根据实验组中差异表达基因的相似表达模式，采用k-means对差异表达基因进行分组。在PS-NPs暴露后，肠道上皮细胞特异性Nrf2缺失小鼠的一个基因簇显示出显著的上调，而在野生型小鼠中没有观察到这种模式（图8B）。基因本体（GO）分析显示，这些基因主要参与白细胞对外部刺激的反应和细胞因子的产生（图8C）。京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析进一步提示，在PS-NPs暴露后，在肠道上皮细胞特异性Nrf2缺失小鼠的肠道免疫网络激活中，Th1、Th2和Th17细胞可能发挥关键作用（图8D）。值得注意的是，在PS-NPs暴露后，肠道上皮细胞特异性Nrf2缺陷小鼠中，Th17细胞标记物的表达增加（图8E）。此外，在Th17细胞分泌的五种细胞因子中，IL-17C的mRNA表达水平特异性升高（图8F）。这一发现强调了Th17细胞及其细胞因子IL-17C在肠道上皮细胞特异性Nrf2缺失小鼠对PS-NPs暴露的反应中的潜在关键作用。![]()
图8 Nrf2fl/fl-VilCre+小鼠PS-NP暴露后空肠的转录组分析。随后，作者通过qPCR和蛋白质印迹分析验证了空肠中的转录结果。Nrf2fl/fl-VilCre+小鼠在PS-NP暴露后空肠中Il-17c表达呈剂量依赖性升高，但在中脑或纹状体中没有（图9A-C）。这表明 PS-NP 暴露后，IL-17C 在空肠中产生增加，但在中脑或纹状体中却没有产生。然而，在Nrf2fl/fl-VilCre+小鼠中，IL-17C水平不仅在空肠中升高，而且在PS-NP暴露后中脑和纹状体中也升高（图9D-G）。![]()
图9 （A）空肠、（B）中脑和（C）纹状体Il-17c mRNA表达。（D）空肠、（E）中脑和（F）纹状体IL-17C蛋白表达。（G）空肠、中脑和纹状体IL-17C的蛋白质印迹代表图像。免疫荧光分析证实了这些发现，显示肠上皮中的Nrf2缺乏加剧了空肠PS-NPs诱导的IL-17C水平升高，中脑SNc和纹状体（图10A-D）。关键的是，PS-NPs暴露后，Nrf2fl/fl-VilCre+小鼠血液中的IL-17C水平升高（图10E）。综上所述，大脑中增加的IL-17C可能起源于空肠，并通过血液运输。![]()
图10 （A）小鼠空肠、中脑黑质区和纹状体IL-17C染色的代表性图像。（B）小鼠空肠、（C）中脑黑质区和（D）纹状体IL-17C染色其定量结果。（E）血浆中IL-17C含量。为了研究从肠道运输的IL-17C是否介导了PS-NPs诱导的Nrf2fl/fl-VilCre+小鼠的PD样神经退行性病变，作者在小鼠体内使用IL-17C中和抗体来阻断IL-17C的过量产生。结果显示，IL-17C中和抗体治疗降低了小鼠血液、中脑和纹状体中IL-17C蛋白的水平（图11A-C）。![]()
图11 （A）血浆中IL-17C含量。（B）中脑IL-17C蛋白水平及蛋白质印迹图像。（C）纹状体IL-17C蛋白水平及蛋白质印迹图像。免疫荧光染色证实了这些发现（图12A）。IL-17C中和抗体处理小鼠成功减少了从肠道到大脑的IL-17C运输。在成功降低小鼠脑内IL-17C水平后，还观察到Nrf2fl/fl-VilCre+小鼠中脑和纹状体中Nissl阳性细胞（图12B）和TH阳性细胞数量（图12C）显著增加。 ![]()
图12 小鼠中脑黑质区和纹状体中IL-17C染色，Nissl染色和TH染色的代表性图像及其定量结果。小鼠运动功能发现有了显著改善，包括活动水平、总移动距离、握力和在转杆上保持平衡的时间（图13A-E）。综上所述，IL-17C在肠道上皮细胞特异性Nrf2缺失小鼠的PS-NPs诱导的神经毒性中发挥了关键作用。 ![]()
图13 IL-17C中和抗体干预后PS-NPs暴露28天对小鼠神经行为学的影响。为了探索肠粘膜微生物群对肠道上皮细胞特异性Nrf2缺失小鼠中PS-NPs引发的神经毒性作用的潜在影响，作者收集了空肠粘膜样本进行16S rRNA测序，并与野生型小鼠进行了比较。微生物群群落的约束主坐标分析（CPCoA）显示基于基因型和PS-NPs暴露的稳健聚类（图14A）。进一步分析显示，暴露于PS-NPs后，肠道上皮细胞特异性Nrf2缺失小鼠的微生物群多样性更高，而在野生型小鼠中没有观察到显著变化（图14B和C）。![]()
图14 （A）空肠微生物群落的主坐标分析。（B）Shannon指数和（C）Simpson指数。作者观察到在WT和肠道上皮细胞特异性Nrf2缺失小鼠之间，以及在有或没有PS-NPs暴露的上皮特异性Nrf2缺失小鼠之间，在肠道微生物谱的基线水平上存在显著差异。在门水平上，暴露于PS-NPs导致WT和上皮特异性Nrf2缺失小鼠中变形杆菌的相对丰度降低。值得注意的是，在暴露于PS-NPs后，肠道上皮细胞特异性Nrf2缺失小鼠中厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门的相对丰度增加，而在野生型小鼠中没有观察到这种变化（图15A）。在目的水平上，假单胞菌表现出显著的减少，而乳杆菌、丹毒杆菌、拟杆菌、梭菌、根瘤菌、放线菌在暴露于PS-NPs后仅在上皮特异性Nrf2缺失小鼠中增加（图15B）。这些数据显示，与野生型小鼠相比，PS-NPs暴露导致上皮特异性Nrf2缺失小鼠肠道微生物群更严重的破坏。![]()
图15 在不同亚群中检测到的（A）前五菌门和（B）前十菌目的分布。由于肠道微生物的共存反映了生态系统内微生物的相互作用，本研究对有或没有PS-NPs暴露的WT和上皮特异性Nrf2缺失小鼠的细菌种类进行了Spearman相关分析（P<0.05，前50个最丰富的物种的相关系数>|0.5|）。在排除不相关的物种后，发现所有四组动物的核心物种主要由厚壁菌门组成。PS-NPs暴露改变了WT和上皮特异性Nrf2缺失小鼠中微生物群生态系统的物种构成（图16A-D）。为深入了解肠道核心物种与IL-17C产生的关系，本研究对物种丰度与空肠IL-17C表达进行Spearman相关分析。结果表明，野生型小鼠空肠核心物种的丰度与IL-17C的表达不呈正相关关系（图16A）。相比之下，在肠上皮特异性Nrf2缺失小鼠的空肠核心物种中，科里杆菌科（Coriobacteriaceae）与IL-17C表达呈正相关（图16B）。暴露于PS-NPs后，支原体（Mycoplasma）和科里杆菌科（Coriobacteriaceae）两种细菌在野生型小鼠空肠核心种中普遍存在，并且与IL-17C的表达呈正相关（图16C）。值得注意的是，在PS-NPs暴露后，上皮特异性Nrf2缺失小鼠显示出更多与IL-17C表达正相关的核心物种，包括支原体、科里杆菌科、中胚根菌和一种未识别的细菌物种（图16D）。结果表明，在PS-NPs刺激下，小鼠体内的核心微生物群倾向于产生IL-17C，在肠道上皮细胞特异性Nrf2缺失小鼠中观察到更高程度的反应性。 图16 （A-D）不同亚群肠道微生物物种共现网络。
接下来，作者使用抗生素治疗的小鼠来研究肠道微生物群是否作为肠道上皮细胞特异性Nrf2缺失小鼠中PS-NPs诱导IL-17C产生加剧的重要来源。在暴露于PS-NPs的两组小鼠中，与生理盐水处理的小鼠相比，抗生素处理的小鼠空肠中和IL-17C蛋白表达显著减少（图17A）。此外，与生理盐水处理的小鼠相比，抗生素处理的小鼠血液中IL-17C水平显着减少（图17B）。抗生素治疗小鼠和生理盐水治疗小鼠中脑和纹状体IL-17C蛋白水平也显著减少（图17C、D）。免疫荧光染色证实了这些发现（图18）。 ![]()
图17 （A)空肠IL-17C蛋白表达水平及蛋白质印迹图像。（B）血浆中IL-17C的含量。（C）中脑和（D）纹状体IL-17C蛋白表达水平及蛋白质印迹图像。![]()
图18 小鼠空肠、中脑黑质区和纹状体中IL-17C染色的代表性图像及其定量结果。白色比例尺代表100 μm。为了评估产生IL-17C的肠道微生物群是否是肠道上皮细胞特异性Nrf2缺失小鼠中PS-NPs诱导的神经毒性加剧的原因，作者进一步比较了暴露于PS-NPs的抗生素处理和生理盐水处理小鼠的行为和神经病理学指标。结果显示，抗生素治疗显著减轻了PS-NPs引起的中脑黑质致密区神经元的损失，特别是多巴胺能神经元的损失，如Nissl和TH染色所示（图19A、B）。然而，本研究观察到纹状体中只有Nissl阳性细胞数量显著增加，而TH阳性细胞数量没有相应增加（图19A、B）。![]()
图19 小鼠中脑黑质区和纹状体Nissl和TH染色的代表性图像及其定量结果。
最后，作者对抗生素治疗的小鼠进行了神经行为学检测，发现抗生素治疗减轻了PS-NPs诱导的神经毒性，表现为运动和协调障碍的改善，运动活动水平恢复（图20A-C），握力增强（图20D），掉落转杆时间增加（图20E）。以上研究结果表明，PS-NPs对肠道微生物群的破坏导致IL-17C的过量产生，从而加剧肠道上皮细胞特异性Nrf2缺失小鼠的神经毒性。
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图20 抗生素治疗干预后PS-NPs暴露28天对小鼠神经行为学的影响。本研究提供了直接的证据表明由PS-NPs引起的肠道变化会影响大脑功能。这主要涉及肠道菌群的生态失调，例如PS-NPs诱导的支原体和科杆菌科的增殖，导致肠道中IL-17C的产生增加。过量的IL-17C通过血液进入大脑，最终导致神经系统损伤。重要的是，本研究发现在PS-Ns暴露的背景下，肠道健康与神经系统不良结果之间存在直接关联。肠上皮特异性Nrf2缺乏的易感小鼠在PS-NPs诱导后，出现更严重的神经毒性。这归因于这些小鼠肠道中与IL-17C产生相关的微生物群丰度增加，例如根瘤菌和洛夫氏菌。本研究加深了肠脑轴在PS-NPs诱导的神经毒性中的调节机制的理解，并强调维持肠道健康对减轻PS-NPs神经毒性的关键作用。南方医科大学博士后梁博萱、公共卫生学院2024级博士生邓艳红、博士后黄煜基和钟怡洲为本文共同第一作者；黄振烈教授为本文独立通讯作者。上述研究得到国家自然科学基金面上项目（82273656，82073519，81872601）、广东省国际科技合作项目（2022A0505050035）、广东省基础应用基础研究基金（2022A1515010610，2022A1515111098，2023A1515110373）、中国博士后科学基金（2023M741553，2023T160295，2022M721486）、国家资助博士后研究人员计划（GZC20231055，GZC20240653）、东莞市社会发展科技专项高水平医院建设项目（20231800905372）、广东省热带病研究重点实验室（2017B030314035）、国家药监局化妆品安全评价重点实验室和广东省药品监督管理局科技创新（国家药监局重点实验室项目2024ZDZ09）的资助。![]()
黄振烈，南方医科大学公共卫生学院副院长、教授、毒理学系主任、博导；广东省医学领军人才，日本名古屋大学医学博士；国家药监局化妆品安全评价重点实验室主要学术带头人和学术委员会委员。主要研究方向为以微纳塑料为代表的新污染暴露与健康效应机制研究，主持国家科技部重点研发计划课题和国家自然科学基金等国家级项目7项，以末位或者独立通讯作者在Environ Health Perspect（2024）、ACS Nano（2024）、Adv Sci（2023a，2023b，2024）、Drug Resist Updat（2023）、J Infect（2021）、J Harzard Mater（2022，2024）、Environ Int（2023，2024）、Part Fibre Toxicol（2021，2023）、Sci Total Environ（2024a，2024b）、Environ Pollut（2023）、Ecotoxicol Environ Saf（2022，2024）、Nanotoxicology（2018）、Toxicol Sci（2017）等毒理学和环境科学领域期刊发表高质量SCI科研论文60余篇。主要学术兼职包括中国毒理学会第三届毒性病理学专委会主任委员、中国毒理学会第八届理事会常务理事、国家药监局化妆品技术规范委员会委员、农业农村部第十届全国农药登记评审委员会委员，Toxicology编委，Environ Health Prev Med编委；《中国职业医学》《华南预防医学》编委等。
通讯邮箱：huangzhenlie858252@smu.edu.cn梁博萱，南方医科大学博士后。主要研究方向为新污染暴露与健康效应机制研究。主持国家自然科学基金青年科学基金项目、中国博士后科学基金面上项目和特别资助项目等国家级项目3项，省级、市级课题各1项。以第一作者（含共同第一）身份在ACS Nano（2024）、Adv Sci（2023a，2023b，2024）、J Harzard Mater（2022）、Part Fibre Toxicol（2021）、Ecotoxicol Environ Saf（2022）等毒理学和环境科学领域期刊发表论文12篇，其中1篇入选ESI 高被引论文。投稿、转载、合作、申请入群可在后台留言（备注：姓名+微信号）或发邮件至sthjkx1@163.com
