国人佳作——厦门大学+中科院营养所团队揭示他汀类药物导致肝脏胰岛素抵抗的分子机制

结果1：短期他汀类药物治疗导致血糖异常和肝胰岛素抵抗

研究者首先设计了一个短期他汀类药物治疗模型，采用为期 3 周的他汀类药物口服管饲方案，然后进行 6-8 周的 HFD 治疗，以评估降脂效果（图 1A）。发现短时间使用他汀类药物治疗的情况下，从小鼠血脂各项指标来看，两种治疗都降低了总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），对高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）没有显着影响（图1C），同时还发现对小鼠体重和食物消耗没有影响（图1B）。这说明成功的建立了辛伐他汀和阿托伐他汀降血脂的动物模型。

作为降血脂的药物，他汀类药物可能具有导致患者肝功能异常、影响患者胰岛素敏感性，引发糖尿病等副作用，因此，研究者使用短期他汀类药物治疗模型，通过测量小鼠葡萄糖、胰岛素相关指标，来探究他汀类药物对糖尿病的影响。研究者测量了模型小鼠的空腹血糖，发现他汀类药物治疗的小鼠的空腹血糖水平明显高于未治疗的小鼠（图1D），且辛伐他汀和阿托伐他汀均加剧了葡萄糖耐量（图1E）和胰岛素耐量（图1F）。并且在他汀类药物治疗之后，血液胰岛素和游离脂肪酸的水平升高（图1G），FFA是与胰岛素抵抗相关的两个高胰岛素血症指数，FFA升高可抑制机体各组织特别是骨骼肌对胰岛素的敏感性，从而引起机体的胰岛素抵抗。表明短期他汀类药物治疗可能导致糖尿病前期。

在胰岛素敏感组织中，胰岛素抵抗可以自行出现，并且是由许多原因造成的。在肝脏、肌肉和附睾白色脂肪组织（eWAT）中检测到 AKT 磷酸化，这是三个突出的胰岛素反应组织。然而，只有肝脏显示出相当大的胰岛素抵抗（图1H）。WB实验、免疫组织化学染色实验以及小鼠原代肝细胞中 AKT1 磷酸化的WB实验结果发现，肝脏中，他汀类药物处理后，胰岛素介导的AKT1磷酸化受到抑制（图1H-J），表明他汀类药物直接诱导肝胰岛素抵抗。短期他汀类药物治疗会导致他汀类药物降血脂小鼠模型中，小鼠的血糖异常，诱导肝胰岛素抵抗。

图1 短期他汀类药物治疗会导致血糖异常和肝胰岛素抵抗 

结果2：他汀类药物增加PAQR9，在体外治疗下影响肝脏胰岛素抵抗

为了确定他汀类药物诱导的肝胰岛素抵抗的主要调节因子，研究者检查了他汀类药物治疗的肝细胞的一些公共测序数据集（GSE24188和GSE84178）。在各种他汀类药物治疗条件下，仅选择了74个同步改变的基因（图2A）。这74个基因的KEGG富集分析显示，他汀类药物诱导的表型涉及6个重要通路（图2B），其中AMPK和PPAR信号转导显示出实质性关联。为了进一步验证研究者的发现，引用了另一个数据集GSE134817，该数据集提到了他汀类药物对肝细胞的一般影响（图2C）。在他汀类药物治疗下，属于AMPK或PPAR通路的一系列基因发生了显著变化，表明对这些信号有强大的影响。

肝脏中一种高度表达的蛋白质，称为 PAQR9，与这两种途径有关（图2C）。在用辛伐他汀或阿托伐他汀治疗的小鼠肝脏中，研究者发现Paqr9 mRNA和蛋白质水平升高（图2D、E）。在分离的肝细胞中也观察到上调（图2F），表明他汀类药物治疗可以直接促进肝脏PAQR9。

随后研究者生成了PAQR9敲低HepG2细胞（图2G）。在他汀类药物治疗下，PAQR9敲低细胞比对照细胞表现出更高的葡萄糖摄取和胰岛素敏感性（图2H、I），类似于 Paqr9−/−（Paqr9敲除小鼠）肝细胞中也表现出了相似结果（图2K）。然而，PAQR9的过表达减弱了AKT磷酸化（图2J）。此外，通过公开的肝脏RNA-seq数据集，糖尿病人群的肝脏Paqr9表达更高（图2L），表明PAQR9是肝细胞中的胰岛素敏感性降低剂。

图2  PAQR9被他汀类药物增加，在他汀类药物治疗下加重肝胰岛素抵抗

结果3：PAQR9 的缺失可改善他汀类药物诱导的胰岛素抵抗

研究者探讨了PAQR9的缺失是否能保护小鼠免受阿托伐他汀诱导的肝胰岛素抵抗（图3A）。结果发现，Paqr9−/−小鼠比野生型小鼠更瘦（图3B），并显示出更好的胆固醇代谢（图3C）。重要的是，阿托伐他汀升高的空腹血糖、胰岛素和游离脂肪酸水平在 Paqr9 −/−小鼠中似乎要低得多（图3D-F），GTT和ITT试验也发现，在阿托伐他汀处理后，Paqr9敲除提高了小鼠对葡萄糖与胰岛素的敏感性（图3I、J）。WB实验表明，Paqr9−/−小鼠中的肝脏AKT磷酸化增加（图3G，H），表明肝脏胰岛素抵抗有所改善。

陈燕研究组已经报道过，Paqr9是肝脏中的一种能量敏感基因，在禁食期间会急剧减少。此外，根据研究者之前的RNA测序结果，热量限制（CR）或禁食模拟饮食（FMD）都会降低肝脏Paqr9的表达（未发表的观察结果）。因此，研究者设计了一种阿托伐他汀联合CR或间歇性禁食 （IF） 模型，以检测这些饮食计划是否可以缓解他汀类药物诱导的糖尿病（图 S3A）。CR和IF都减少了肝脏PAQR9蛋白的量（图S3H），也大大降低了血清中的空腹血糖水平以及胰岛素和FFA（图S3E，F）。此外，胰岛素耐受性也通过饮食干预得到持续改善，特别是肝脏胰岛素信号传导（图S3G-I），表明对他汀类药物副作用的干预是可行的。总体而言，PAQR9 缺乏可逆转他汀类药物诱导的肝胰岛素抵抗和糖尿病。

图3  PAQR9的缺失可改善他汀类药物诱导的胰岛素抵抗

结果4：PAQR9通过PPM1α调节胰岛素敏感性

早期研究报道，PAQR9是一种ER定位支架蛋白。研究者使用亲和捕获质谱（AP-MS）来寻找与Flag和Myc标记的PAQR9相互作用的蛋白质，以更好地了解PAQR9在胰岛素信号通路中的功能（图4A）。在HepG2细胞中，388种蛋白被两种标记的PAQR9拉低，其中21种蛋白具有磷酸酶或激酶注释。研究者关注的是PPM1α，称为蛋白磷酸酶2Cα（PP2Cα），是排名最高的磷酸酶之一（图4A）。有趣的是，肝脏PPM1α似乎与糖尿病和肝骨病有关（图4B；图S4A）。

研究者采用免疫共沉淀（co-IP）验证了PAQR9和PPM1α的相互作用，发现 Flag-PAQR9在测定中与外源性和内源性PPM1α相互作用（图4C、D;图S4B）。免疫荧光染色发现PAQR9和PPM1α部分共定位在HepG2细胞的ER中（图4E），进一步表明这两种蛋白质的相互作用。紧接着研究者在Paqr9−/−小鼠肝脏中检测了PPM1α的表达量，WB结果发现，在Paqr9−/−小鼠肝脏中，PPM1α蛋白表达量高于对照组（图4F），并且当他汀类药物治疗时，PPM1α蛋白水平下降和PPM1α水平在用他汀类药物治疗时下降（图4G），前面的研究结果发现他汀类药物治疗使肝细胞中PAQR5的水平升高，那么结合以上实验，表明PPM1α与PAQR9呈负相关。

研究者测量了他汀类药物治疗下的胰岛素敏感性，以确定PPM1α是否参与胰岛素敏感性的控制。如图4H，I 所示，在他汀类药物治疗后，PPM1α过表达逆转了AKT磷酸化，但 PPM1α抑制剂血根碱进一步降低。PAQR9对胰岛素敏感性的影响可以通过PPM1α来挽救（图4J;图S4C），揭示了PPM1α在胰岛素信号通路中位于PAQR9的下游。

图4 PAQR9通过抑制PPM1α-ERK1/2通路来减弱肝脏胰岛素敏感性

结果5：PPM1α 通过 ERK1/2 磷酸化调节胰岛素敏感性

尽管已经表明 PPM1α调节胰岛素信号通路，但其影响和机制因器官的不同而有很大差异。研究者采用AP-MS对与Myc-PPM1α相互作用的1088个蛋白质KEGG分析表示，发现核心信号通路是PI3K-AKT信号通路和AMPK信号通路。在MS中观察到ERK1，ERK2和MEK2，PPM1α可以在Co-IP测定中降低所有这些结果（图4L）。那么为了探究ERK、AKT和PPM1α之间的关系，研究者通过蛋白质印迹法检测了用不同量的Myc-PPM1α过表达的HepG2细胞中的 AKT1 和ERK1/2磷酸化。从图M中观察到，PPM1α的过表达减少ERK1/ 2磷酸化，但以剂量依赖性方式增加AKT1磷酸化（图4M），而PPM1α缺失增加了胰岛素刺激下的ERK1/2磷酸化（图4N）。因此，这些发现表明PPM1α通过平衡肝细胞中的ERK和AKT通路来增强胰岛素信号传导。

结果6：PAQR9介导PPM1α STUB1的泛素化和降解

然后，研究者专注于PAQR9对PPM1α介导的AKT磷酸化的控制。图4F表明，PAQR9的缺失导致PPM1α蛋白水平升高，这在CR或IF小鼠中也观察到（图S3H）。研究者观察了PAQR9缺失或过表达的HepG2细胞中PPM1α的稳定性，以确定PAQR9是否影响PPM1α降解。PAQR9缺失延长了PPM1α在HepG2细胞中的半衰期（图5A），但过表达加快了PPM1α降解的速度（图5B）。据报道，PAQR9 通过泛素-蛋白酶体途径调节蛋白质稳定性，研究者发现PAQR9过表达促进了 PPM1α的多泛素化（图5C），表明PAQR9通过泛素-蛋白酶体依赖性途径促进 PPM1α蛋白的降解。

根据AP-MS的结果，研究者发现了241种蛋白质与PPM1α和PAQR9相互作用，其中11种是E3连接酶（图5D）。其中一种共相互作用的连接酶是STUB1，也称为CHIP，其伴侣HSPA8也被鉴定出来。Co-IP测定证实了STUB1与其他两种蛋白质之间的相互作用（图5E；图S5A、B）。通过免疫荧光实验鉴定了HepG2细胞中三种蛋白质的共定位（图5F）。重要的是，STUB1 的过表达增强了PPM1α泛素化并加速了其降解（图5G、H），表明STUB1是PPM1α的E3连接酶。

为了进一步探讨PAQR9是否介导STUB1对PPM1α降解，研究者在STUB1缺失的HepG2细胞中检测了PPM1α和胰岛素信号。如图5I 所示，STUB1缺失提高了PPM1α蛋白水平并增强了HepG2中的 AKT 磷酸化。PAQR9过表达显着降低PPM1 α，PAQR9过表达在STUB1突变细胞中消失（图5I），表明STUB1是PAQR9介导的PPM1α降解所必需的。此外，血根碱能够减弱STUB1缺失增加的胰岛素敏感性（图5J），显示 PPM1α是STUB1的下游靶标。此外，他汀类药物治疗在体内和体外对STUB1的表达没有显着影响（图S5E、F），表明他汀类药物加速的PPM1α降解是由PAQR9介导的，但不是直接由STUB1介导的。总体而言，这些发现表明，STUB1介导的PPM1α降解是PAQR9抑制PPM1 α-ERK1/2-AKT通路的机制。

图5 PAQR9通过与STUB1的相互作用介导PPM1α的多泛素化和降解

结果7：HNF4a是PAQR9在他汀类药物作用下的负转录因子

前面的实验已经讨论了PAQR9-STUB1-PPM1α轴在控制胰岛素信号传导中的作用，然而，他汀类药物治疗如何诱导PAQR9表达尚不清楚。因此研究者使用ChEA3评估阿托伐他汀治疗下差异表达基因的转录因子，以研究他汀类药物治疗引起的原发性转录改变。在排名前20的TFs中，研究者发现了某些关键因素，包括HNF4α、NR1H4、MLXIPL和NR1I2（图6A，B）。另外，研究者使用QIAGEN和Cistrome DB预测的PAQR9 TFs，发现HNF4α也是预测的PAQR9 TFs之一（图6C）。因此研究者对HNF4α展开研究。

研究者使用JASPAR检查了人Paqr9启动子区域中三个假定的HNF4α结合位点（图6D）。然后，随后研究者使用 ChIP-qPCR验证了 HNF4α 可以直接在预测位点#2和#3与人Paqr9启动子结合（图6E）。那么接下来研究者使用双荧光素酶报告基因实验在HepG2细胞中检查了Paqr9基因的启动子活性，来确认 HNF4α是否参与 Paqr9 基因表达的控制。从图6F中观察到，过表达HNF4 α的荧光素酶活性得到缓解，表明 HNF4α负调控Paqr9 的 表达，尤其是在−1k/+70 bp段上。WB结果发现，HNF4α的敲低升高了PAQR9蛋白水平，无论是否他汀类药物治疗（图6G）。

在前面的研究中，发现在他汀类药物治疗下，Paqr9基因表达增加（图2）。然而，在HepG2细胞或小鼠肝脏中，他汀类药物都没有改变HNF4α的mRNA和蛋白质（图6H，I）。接下来，研究者分析了HNF4α的下游靶点。结果发现，在他汀类药物治疗下，包括Ulk1、Cyp7a1和Lipc在内的各种靶点均在体内下调（图6J），表明他汀类药物对HNF4α的功能抑制，这与他汀类药物治疗下，Paqr9表达的增加一致。通过分子对接模拟，我们发现辛伐他汀和阿托伐他汀都可以直接与HNF4α结合（图S10），这可能是抑制的原因。

有研究表明，HNF4α基因突变与二型糖尿病和年轻人成熟型糖尿病 （MODY） 的风险有关。另外，在HFD小鼠中，肝脏HNF4α消融导致胰岛素抵抗。本研究中，研究者发现无论他汀类药物治疗如何，HNF4α敲低都会损害 AKT 磷酸化（图 6G）。在HepG2或小鼠原代肝细胞中，过度表达HNF4α或使用HNF4α激活剂苯氟乐，可部分挽救他汀类药物的影响。通过上述研究发现他汀类药物可能通过抑制HNF4α引起肝胰岛素抵抗。

图6 HNF4α是PAQR9对他汀类药物反应的阴性转录因子

结果8：Benfluorex联合治疗或肝特异性PPM1a过表达是短期他汀诱导糖尿病的潜在治疗方法

图7 Benflurex联合治疗或肝脏特异性过表达PPM1α是他汀类药物诱导的肝胰岛素抵抗的潜在疗法