关于生物实验当中的标准曲线常见问题解答

美食   2024-11-07 17:04   山东  


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标准曲线的制作中,会有这样那样的问题,比如常有人问:一定要做5个点?线性相关系数R值必须几个9才达标?标曲是每天都做还是每次都做?标曲是否必须通过原点?……


1.标准曲线的制作依据?


GB/T22554-2010《基于标准样品的线性校准》中:

1)标准曲线的浓度范围应覆盖正常操作条件下的被测量范围;

2)标准样品的组分尽量与被测样品组分一致;

3)标准样品的浓度值应等距离的分布在被测量范围;

4)标准样品的个数至少应有3个浓度;

5)每个标准点至少重复2次,这个重复是指从稀释开始;如果国家标准有相应的浓度系列推荐,尽量按国家标准。工作中我们经常采用线性校准,因为线性方程最为简洁。


2.什么是校准曲线?


校准曲线包括标准曲线和工作曲线,前者用标准溶液系列直接测量,没有经过预处理过程,这对于样品往往造成较大误差;而后者所使用的标准溶液经过了与样品相同的消解、净化、测量等全过程。



3.首先标曲要做几个点?


3个点:对于一些低浓度,特别是微量分析,并且浓度范围不是很大的,检测器响应可靠,背景干扰非常小的,则可以选用较少的工作点就行,一般有3个浓度点就足够了,有些甚至可以只用一个浓度点就行,另一个点直接用坐标原点。


4~6个点:对于平时测量的样品浓度范围较宽,并且检测器响应不完全是一次曲线(直线)的,可以采用二次曲线或分段校正方式,以减少数据偏差,这种情况就需要多用几个数据点,如果不分段,数据点有4~6个就够用。



4.标曲R值是几个9才合格?


实验室应按检测标准(方法)的要求使用标准溶液或标准物质建立标准曲线。所用标准溶液或标准物质应覆盖被测样品的浓度范围。检测标准(方法)如无具体的要求,至少使用5个标样(除空白外)建立线性标准曲线,每个点重复测定1-3次,对于筛选方法,线性回归方程的相关系数不应低于0.98,对于确证方法,相关系数不应低于0.99。其实,大于0.99是判断是否为线性相关的一个标准,实际应用中线性大于0.999才是比较理想的。线性在0.99到0.999之间的监测结果只用接近最高浓度一半(中间浓度)的位置才比较准确,如果线性大于0.999的话,在整个线性范围内都会有一个比较满意的结果。

如果检测的线性不好,可以减少标准的覆盖范围,将标准的浓度调整到待测样品浓度附近,这样结果也是非常准确的。


5.标准曲线有效期的规定?


(1)标准曲线属于实验室质量控制的范围,按照《实验室资质认定评审准则》中结果控制的要求:

定期使用有证标准物质(参考物质)进行监控和/或使用次级标准物质(参考物质)开展内部质量控制。

(2)准则中并未对“定期”进行规定,所以如果“定期”,就根据实验室的实际情况来定了。

(3)既然准则上没说明,那根据一般的分析教材,当实验条件(包括药剂、人员、仪器等)发生变化时,最好重新制作标准曲线。一般来说仪器如果长期使用,并经过检定,是处于稳定状态,而人员药剂的变化往往会较大。如果说每次换个人操作都要换曲线,那工作量就太大了。


6.每次开机都必须做标准曲线?


从药品检测的要求来说,因为:

1.每天所配的流动相都会有所不同,导致出峰的时间都会有一定的差异,峰面积相应都有所差异。

2.检测器光能也在不断的衰弱,因此其每天的相应值也有所不同,其峰面积也有差异。基于以上原因,原则上应该是每天都要进行标准曲线校正的。标准曲线不要每次都做,但是每次必须进标准品样品;因为每次你的流动相和原来的不可能完全一样,同时仪器的状态也在变化,所以不同批次间的保留时间是不一致的,所以你必须用随行标准品来定位与定量。


7.校准曲线能不能长期使用?


不能长期使用,可以短期使用,使用前做一个单点重校,测试一个零点和中间点,测出一个纠正过的曲线。


8.标准曲线是否必须过原点?


看要求,如果零点的有效值是小数点后面第四位才有数字不影响测试,超过0.001就不行了。


9.标准曲线的线性范围?


最高点一定要大于被测试样品(物质)10%。


10.相关系数的有效数字?


至少二位以上。


11.Y=bX和二次曲线的选用?


看标准要求,以国标或行业标准为依据。测试范围窄的建议使用一次线性方程,测试范围宽点使用非线性或二次方程。


12.校准曲线的斜率、截距保留几位有效数字?


1.参考依据,参考标准HJ630,其他行业参考使用。

2.相关系数R保留的有效数字,校准曲线相关系数只舍不入,保留到小数点后第一个非9数字。如果小数点后多于4个9,最多保留4位。

3.校准曲线斜率的有效位数,校准曲线斜率的有效位数,应与自变量的有效数字位数相等。

4.校准曲线截距的有效位数,校准曲线截距的最后一位数,应与因变量的最后一位数取齐。

5.自变量和因变量的有效数字,记录测定数值时,应同时考虑计量器具的精密度、准确度和读数误差。对检定合格的计量器具,有效数字位数可以记录到最小分度值,最多保留一位不确定数字。


文章来源:网络转载;

文字编辑:食品小叶;

内容审核:食品小管;

封面图片:创客贴会员;

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