Morita-Baylis-Hillman (MBH)反应是一种重要的C-C键形成反应，是指在亲核催化剂 (例如：活化烯烃)与亲电试剂(例如：醛)之间形成C-C键的原子经济反应，其产物具有广泛的生物活性，包括抗癌、降糖、抗炎、抗病毒、抗菌等。开发高效的酶催化MBH反应方法，将极大促进手性药物合成，推动制药工业的发展。然而，现有化学催化剂的手性高度依赖于底物的结构，限制了MBH反应的广泛应用。在自然界中，还没有发现任何天然酶能有效地催化MBH反应，只有血清白蛋白和脂肪酶等少数酶对MBH反应表现出低水平的混杂活性。为了解决上述问题，刘立明教授带领团队通过计算设计和定向进化结合，开发了一个人工MBHase，具有较高的催化效率和优良的立体选择性。
该研究基于MBH反应与老黄酶（OYEs）天然还原反应之间的底物相似性，开发了OYEs催化非天然MBH反应的混杂功能。首先，通过质谱、光谱和对照实验证实了GkOYE既可催化还原反应也可催化MBH反应，这一混杂性催化功能也见于其他几种OYEs (NemA、XenA、GluER、MR)，为开发高效催化该反应的酶提供了全新思路。随后，为提高GkOYE催化MBH反应的效率，分析了OYEs催化天然还原反应的机制，提出阻断H-和H+转移途径以消除还原活性，强化MBH催化功能的策略，结合丙氨酸扫描和组合诱变得到了还原活性下降98.3%，而MBH活性提高141.4%的GkOYE.8突变体。为进一步阐明其催化MBH反应的机理，测定了GkOYE.8的蛋白结构，结合定点突变、分子对接和动力学模拟等手段，证实了残基C26、E59和H164在催化MBH反应中起关键作用：C26作为亲核催化残基参与MBH反应；E59通过水介导的氢键网络去质子化C26巯基，增强其亲核性；His164没有直接参与MBH反应，但可能与支持合适的催化构象有关。计算结果系统阐释了GkOYE催化MBH反应的分子机制，为后续酶改造奠定了基础。随后，通过提高底物结合亲和力和翻转产物选择性的策略进行蛋白质工程改造，获得了对映体互补的突变体GkOYE.11和GkOYE.13，其中，GkOYE.11的产率达77.8%，e.r.值为89:11；GkOYE.13的产率为63.1%，e.r.值为23:77。最后，利用获得的立体选择性互补的两种最佳突变体探究了底物普适性范围，GkOYE.11 和 GkOYE.13 能接受多种芳香醛底物，优先接受对位取代的衍生物，产物的立体选择性因取代基的位置和类型而不同。这些结果标志着催化MBH反应的高效OYE变体的成功构建，为手性MBH产物的酶法合成提供了全新工具。
▲ 图形摘要
生物工程学院发酵工程专业2018级博士生王蕾为论文第一作者，刘立明团队宋伟副研究员为论文通讯作者。上述研究得到了国家重点研发计划(2021YFC2100100)、国家自然科学基金(22378165)等资助。
近年来刘立明教授团队以合成生物学科学理论为指导，在高效合成高值化合物细胞工厂构建及酶工程方面开展了系统性的研究，并取得了一系列原创性研究成果，部分成果已发表在Nature Catalysis (2021, 2020)、Nature Communications (2024, 2022, 2021, 2019, 2018)、Angewandte Chemie International Edition (2024, 2023, 2022)、Chemical Engineering Journal (2024, 2023)、ACS Catalysis (2021, 2020,2017)、ACS Sustainable Chemistry & Engineering (2024, 2023)等本领域权威期刊。
编辑丨刘 垚
审核丨聂 尧
责编丨韩 俊
