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巨噬细胞、衰老等作为国自然超热点，各位小伙伴一定不陌生。那衰老样巨噬细胞、血管生成大家又了解多少呢？二者又有什么样的联系呢？今天给大家介绍一篇结合了巨噬细胞+免疫衰老+血管生成的组合研究。血管新生-成骨耦联是骨新生的重要机制，在终板硬化中是否存在血管新生-成骨耦联？如果存在，终板内血管新生的机制是什么？带着这些疑问跟着我一起学习吧！
本研究是郑州大学第一附属医院倪双飞团队2024年4月在Nature Communications上发表的题为“Senescent-like macrophages mediate angiogenesis for endplate sclerosis via IL-10 secretion in male mice”的一篇文章，一起Go Go~~~
1.本研究通过构建脊柱不稳定性（LSI）和老化、小鼠模型，主要采用免疫荧光染色、三维微计算机断层扫描（micro CT）、实时定量PCR和Western Blot等技术进行结果验证。分析了终板硬化区域的血管生成和细胞衰老情况。
2.本研究聚焦于衰老样巨噬细胞介导的血管生成在终板硬化过程中的核心作用，提供了理解免疫衰老与血管新生、终板硬化之间联系的信息，对非特异性腰痛的治疗提供了新的思路。PS：有相关研究的小伙伴，但又迫于没思路，找我。想要了解生信数据挖掘、不知如何创新的小伙伴也找我，我能为你提供各种具有特性的优质服务，欢迎滴滴！
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题目:雄性小鼠衰老样巨噬细胞通过分泌IL-10介导终板硬化的血管生成
杂志:Nature Communications
影响因子：14.7
发表时间：2024年4月
研究背景
腰背痛（LBP）是全球范围内常见且重要的致残原因。脊柱终板硬化是脊柱退行性变或老化的重要特征，但其机制尚不明确。研究表明，细胞衰老在骨骼老化过程中起重要作用，尤其是巨噬细胞在外部刺激下会发生表型和功能变化，从而影响局部免疫反应和代谢稳态。
研究思路
作者通过构建脊柱不稳定性（LSI）和老化小鼠模型，采用免疫组化、番红固绿染色、三维微计算机断层扫描（micro CT）、实时定量PCR、western blot等技术，分析了终板硬化区域的血管生成和细胞衰老情况。此外，通过敲除巨噬细胞中的cdkn2a(p16)基因和使用IL-10中和抗体，研究了这些因素在终板硬化中的作用。研究揭示了衰老样巨噬细胞在脊柱终板硬化中的作用，并探讨了其通过分泌IL-10促进血管生成的机制。
研究结果
1.CD31+Emcn+血管出现在LSI和老年小鼠的终板硬化中
作者首先探究了CD31+Emcn+血管在腰椎不稳定（LSI）或老龄小鼠终板硬化中的作用。免疫荧光染色显示，这些血管在LSI手术后4周和8周，以及20月龄小鼠的硬化终板内显著增加，而在假手术小鼠或3月龄小鼠的软骨终板中未观察到明显的CD31+Emcn+血管的生长。micro CT分析（显微显微计算机断层扫描）证实，LSI手术或老龄小鼠的终板孔隙度显著增加（图1a-h）。同时，番红固绿染色发现，LSI手术或老龄小鼠终板的退变评分显著升高（图2k-l）。进一步的免疫组化结果表明，与对照组小鼠相比，LSI手术后4周和8周或20月龄小鼠中退变终板内（Osx）+成骨前体细胞和（OCN）+成骨细胞的数量也显著增加（图1m-r）。上述这些结果表明退变终板的硬化可能依赖于CD31+Emcn+血管。
图1CD31+Emcn+血管出现在LSI和老年小鼠的硬化端板中
2.衰老细胞在LSI小鼠和衰老小鼠的硬化终板中积累
为阐明细胞衰老在脊柱终板硬化中的潜在作用，作者首先进行了SA-βGal染色，结果发现LSI术后4周和8周的终板中SA-βGal+细胞数量显著增加。在终板中也观察到HMGB1在终板中的整体重新定位以及HMGB1+细胞的数量显着减少（图2a-b）。作者使用衰老报告转基因小鼠Cdkn2a (p16)tdTom（周期蛋依赖性激酶抑制剂），免疫荧光染色结果显示，LSI术后4周和8周终板tdTom+细胞数量显著增加（图2a-c）。为了进一步确定衰老的存在，作者进行了qRT-PCR分析。结果表明LSI手术小鼠中Cdkn2a (p16)、Trp53 (p53)、Cdkn1a (p21)、IL-1β和IL-6的mRNA表达显著高于对照组。作者还评估了衰老过程中终板中的细胞衰老。SA-βGal染色或免疫荧光染色显示老龄小鼠终板中SA-βGal+和tdTom+细胞的数量及上述基因的表达也显著增加，以及HMGB1的表达改变（图2h-l）。总之。这些数据表明退变终板内存在细胞衰老的现象。
图2衰老细胞积聚在LSI小鼠和老年小鼠的硬化性端板中
3.在LSI和衰老小鼠中，衰老细胞的清除延迟了终板的硬化
基于上述实验发现，作者推测细胞衰老可能与终板退变过程中的血管生成和成骨有关。达沙替尼加槲皮素（D+Q）是典型且公认的选择性清除衰老细胞的药物。作者对LSI手术小鼠和老龄小鼠分别给予了D+Q的药物治疗（图3a{左图}）。SA-βGal和免疫荧光染色结果显示，D+Q处理显著减少了LSI手术后和老龄小鼠终板中SA-βGal+细胞和tdTom+细胞的数量，抑制了LSI和老龄诱导的血管生成，并显著减缓了终板硬化的进展（图3b-e{左图}）。CD31和Emcn的共免疫荧光染色和Micro CT分析显示，D+Q治疗后消除了LSI诱导的终板血管生成和终板硬化（图3f-i{左图}i）。此外，D+Q处理还显著降低了终板内Osx+成骨前体细胞的数量（图3l-m{左图}）。
为进一步证实上述发现。作者还给老年小鼠注射了D-Q（图3a{右图}）。SA-βGal染色显示，D+Q处理显著抑制了抗体诱导的终板中SA-βGal+细胞数量的增加，且降低了CD31+Emcn+血管数量（图3b-e{右图}）。micro CT分析和番红固绿染色表明D+Q治疗部分阻碍了20个月龄小鼠的终板硬化。D+Q处理后，20月龄小鼠终板中Osx+成骨细胞祖细胞的数量也显著减少（图3j-k{右图}）。总之，这些研究结果表明，D+Q可以通过清除衰老细胞，抑制LSI或老龄引起的终板的血管生成和硬化改变。
图3在LSI和衰老小鼠中，衰老细胞的清除延迟了终板的硬化
4.在LSI小鼠和老年小鼠的终板中，有大量的巨噬细胞发生衰老
为鉴定退化终板中的衰老细胞类型，作者利用Cdkn2a(p16)tdTom报告小鼠，进行F4/80与tdTom免疫荧光共染色。结果显示LSI手术后4周、5周、8周和20月龄小鼠的终板中F4/80+tdTom+细胞数量显著增加（图4a-d）。流式细胞术结果进一步证实了该发现（图5e-f）。此外，免疫荧光染色结果也显示，F4/80+细胞内DNA损伤标志物SADS和γH2A.X的表达也显著增加，进一步证实了F4/80+巨噬细胞是退变终板内重要的衰老细胞类型（图4g-j）。随后的F4/80与CD31共染色显示，F4/80+细胞与CD31+内皮细胞相邻，这表明在LSI手术小鼠（图5k）或20月龄小鼠（图5l）的终板中，巨噬细胞与血管生成的潜在相关性。综上所述，这些结果表明，衰老样巨噬细胞在退变终板中经历衰老，其可能参与了终板内血管生成和终板硬化过程。
图4在LSI小鼠和老年小鼠的终板中，有大量的巨噬细胞发生衰老
5.在Lyz2+细胞中敲除cdkn2a（p16）可以消除终板硬化
为了进一步阐明衰老样巨噬细胞在终板硬化症发展中的作用，作者将Lyz2-Cre小鼠与Cdkn2a (p16)Flox小鼠一起培养，获得Lyz2+细胞中特异性敲除Cdkn2a的基因敲除小鼠模型（Cdkn2aΔLyz2）（图5a）。免疫荧光结果显示，特异性敲除Cdkn2a显著抑制了LSI手术小鼠终板中CD31+Emcn+血管的新生（图5b-c）。Micro-CT和番红固绿染色结果表明，特异性敲除Cdkn2a也显著抑制了LSI介导的终板退变，并降低了终板内Osx+成骨前体细胞数量（图5d-i）。本研究作者还发现与Cdkn2af/f小鼠相比，Cdkn2aΔLyz2小鼠在LSI手术后终板中CGRP+感觉神经密度显著降低（图5j-k）。这些结果表明，特异性敲除Lyz2+细胞中的Cdkn2a可抑制LSI介导的终板的血管生成和硬化改变。
图5在Lyz2+细胞中敲除cdkn2a（p16）可以消除lsi诱导的终板硬化
6.巨噬细胞的缺失可抑制LSI-或衰老诱导的终板硬化
考虑到退行性终板中衰老样巨噬细胞的高部分，作者接下来研究了去除巨噬细胞是否可以防止退行性终板中的血管生成和硬化。作者将Lyz2-Cre小鼠与B6-iDTR小鼠一起培养,获得Lyz2cre
iDTR小鼠（命名为iDTRΔLyz2）通过白喉毒素（DT）注射特异性敲除Lyz2+细胞。免疫荧光染色显示，iDTRΔLyz2小鼠在LSI手术后8周，终板中F4/80+细胞数量减少，证实了DT注射的有效性。DT注射液显著抑制了LSI术后8周时iDTRΔLyz2小鼠终板中CD31+Emcn+血管的生长（图6a-c{左}）;同样micro CT分析显示，DT注射LSI手术iDTRΔLyz2小鼠的终板硬化也明显延迟，终板孔隙率下降（图6d-e{左}）。此外，番红固绿染色染色证实了iDTRΔLyz2小鼠在LSI治疗后注射DT后终板硬化的延迟（图6f-g{左}）。DT注射也显著降低了LSI诱导的Osx+成骨细胞的增加（图6h-i{左}）。
氯膦酸脂质体（CL）对巨噬细胞的消耗是有效的。作者在老年小鼠中进一步验证上述结果，通过注射CL去除巨噬细胞。免疫荧光染色结果证实了有效的消耗，显示CL注射后20个月龄小鼠终板中F4/80+细胞数量减少（图6a{右}）。免疫荧光染色证明，20个月龄小鼠终板中CD31+Emcn+血管的面积显著减少（图6b-c{右}）。显微CT检查显示，在20个月龄小鼠中，经CL治疗后，部分挽救了终板硬化症（（图6d-e{右}）。同样，番红固绿染色显示，20个月龄小鼠的终板硬化减少（图6f-g{右}）。进一步的免疫组化染色检测，20个月龄小鼠的终板中Osx+成骨细胞祖细胞的存在也被CL处理所抑制（图6h-i{右}）。综上所述，巨噬细胞消耗液CL可以防止衰老诱导的血管生成和终板硬化。
图6巨噬细胞的缺失可抑制SLI（左图）和衰老（右图）诱导的终板硬化
7.由衰老样巨噬细胞分泌的IL-10有助于退行性终板中的血管生成
为了阐明衰老样巨噬细胞介导的终板血管新生的潜在机制，作者首先分析了免疫系统功能的九类目标基因（包括细胞表面受体、应激反应、氧化还原酶、蛋白酶、转录转子、信号转导、细胞因子和细胞因子受体、趋化因子和趋化因子受体、细胞周期和蛋白激酶）。研究发现，与3月龄小鼠相比，20月龄小鼠终板中Il10(IL-10)、Tnf(TNF),、Il1b(IL-1β),、Nfkb2(NFκB2)
等多个基因的mRNA水平显著升高（图7a-b）。免疫荧光染色进一步显示，退变终板中tdTom+F4/80+衰老样巨噬细胞是IL-10的主要来源（图7c）。通过体外实验发现，H2O2可诱导骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）的衰老，并显著增加IL-10的表达，其上清液可促进血管内皮细胞的管腔形成（图7d-e）。IL-10中和抗体2A5有效抑制了H2O2处理的BMDMs上清液诱导的血管内皮细胞管腔形成（图7g-i）。免疫荧光染色显示，2A5处理显著抑制了终板中CD31+Emcn+血管的新生（图7k-l）micro CT分析（图7m-n）和番红固绿染色（图7o-p），2A5抑制了LSI手术小鼠终板的硬化。通过免疫组化染色检测，LSI手术小鼠终板中Osx+成骨细胞祖细胞的存在及也CGRP+纤维的神经支配被抑制（图7q-t）。表明，2A5显著抑制了LSI介导的小鼠终板中的血管生成和硬化（图）。总之，这些发现揭示了IL-10在衰老样巨噬细胞诱导的退行性终板血管生成和硬化中至关重要。
图7由衰老样巨噬细胞分泌的IL-10有助于退行性终板中的血管生成
8.IL-10刺激pSTAT3信号通路诱导血管生成
最后为进一步探索IL-10介导的血管生成的信号通路，作者首先选择了多个与血管生成相关的因子（包括VEGFA、MMP2、PDGFB、MMP9、FGF2、VEC和HIF-1α），qRT-PCR显示IL-10显著促进了这些基因中VEGFA、MMP2和PDGFB的mRNA表达（图8a）。Western blot进一步证实了IL-10可显著增加血管内皮细胞中的VEGFA、MMP2和PDGFB的蛋白表达（图8b），同时激活pSTAT3（磷酸化信号转导和转录激活因子3）/STAT3通路。STAT3通路的选择性抑制剂Stattic可部分抑制IL-10介导的这些蛋白的表达增加（图8d-e）。此外，磷酸化STAT3免疫共沉淀（ChIP）结果表明IL-10显著增加了pSTAT3在VEGFA、MMP2和PDGFB启动子上的特异性结合（图8f-g）。综上，这些结果表明IL-10可以通过pSTAT3/STAT3信号通路促进血管内皮细胞中VEGFA、MMP2和PDGFB的产生，进而促进血管生成。
图8IL-10刺激pSTAT3信号通路诱导血管生成。
文章小结
综上，本研究揭示了衰老样巨噬细胞主要通过IL-10分泌介导的血管生成在老龄化小鼠椎板硬化中的关键作用。提示由衰老巨噬细胞引发的终板硬化可能是脊柱退化的潜在治疗靶点，为开发新的治疗策略提供了科学依据。整体来说，工作难度不大，文章思路清晰完整，主题内容主要是通过免疫荧光染色、micro CT等方法进行实验的验证，各位小伙伴可以参考学习哦！小伙伴们如果对这方面的内容感兴趣，我可以为你们提供思路设计，当然如果你们有其他的困扰（比如生信分析），都可以滴滴我，我随时为你们解答！
