洋葱伯克霍尔德菌群（Burkholderia cepaciacomplex，BCC）是一组表型相似、基因型不同的革兰阴性杆菌，广泛存在于土壤和水中，可引起囊性纤维化、慢性肉芽肿患者或低免疫力易感人群的严重感染，甚至危害生命，对公众健康构成严重危害。BCC 污染导致的医院爆发性感染事件和药品召回案例频发，美国食品药品监督管理局（FDA）发布的2004—2011年因微生物污染召回事件中，BCC污染占比达 34%。FDA 将 BCC 归为不可接受的微生物，并明确要求非无菌水性基质药品关注BCC的检查和控制。
2021 年 9 月 FDA 发布了《非无菌药品生产中的微生物质量考量》行业指南草案，阐述了非无菌水性基质药品受BCC污染的风险及控制，同时明确参照美国药典（USP）<60>进行BCC的检测。
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2021年11月国家药品监督管理局药品审评中心发布的《化学药品创新药上市申请前会议药学共性问题相关技术要求》明确要求对于吸入、口服、黏膜、皮肤和鼻腔给药的水溶液非无菌制剂，一般应参照相关技术要求对洋葱伯克霍尔德菌进行研究，并制定相应的控制策略。欧盟和日本药品监管机构尚未对 BCC 的控制提出监管意见。结合笔者近几年对于非无菌水性基质药品审评中发现，国内研究者对于BCC认识尚处于起步阶段，少有研究者主动基于产品风险开展必要的控制菌筛查和探索，已提交的非无菌水性基质药品上市申请中普遍存在BCC研究不充分的问题。
BCC 在营养有限的水性环境中有较强的生存能力，且对治疗用抗菌药和抑菌剂有广泛的耐药性，非无菌水性基质药品中存在BCC的潜在风险较高，因此建立 BCC预防及控制策略对药品安全至关重要。本文对BCC的特性、检测及风险评估和控制策略进行阐述，为非无菌水性基质药品中BCC的研究和控制提供参考。
洋葱伯克霍尔德菌最早由美国植物病理学家Walter H. Burkholder 首次从洋葱根部分离发现，因引起洋葱根茎腐烂而得名。依据 16S-rRNA基因测序等技术，BCC 被分为表型相似基因型不同的 9 个基 因 型 ：B. cepacia genomovar I、B. cepaciagenomovarⅡ（B. multivorans）、B. cepacia genomovarⅢ（B. cenocepacia）、B. cepacia genomovar Ⅳ（B.stabilis）、B. cepacia genomovar V（B. vietnamiensis）、B. cepacia genomovar Ⅵ（B. dolosa）、B. cepaciagenomovar Ⅶ（B. ambifaria）、B. cepacia genomovarⅧ（B. anthina）、B. cepacia genomovar Ⅸ（B.pyrrocinia），其 中 洋 葱 伯 克 霍 尔 德 菌（B. cepaciagenomovar I）是 自 然 界 分 离 获 得 最 常 见 的 菌 株之一。
BCC是一类在土壤、水中普遍存在的革兰阴性杆菌，是引起感染的条件致病菌，可造成免疫力低下的易感人群或囊性纤维化和慢性肉芽肿患者严重感染，约1/3的BCC感染患者最终发展为败血症，同时 BCC 污染引发的包括重症监护室、血液透析室、内窥镜检查室等医院感染事件频发。BCC具有多重固有的抗菌药物耐药性，耐药机制包括降低外膜通透性、诱导产生 β 内酰胺酶和外排泵作用等，对临床常用的 β-内酰胺类、多黏菌素、以及氨基糖苷类抗菌药物都有一定耐药性，这导致BCC感染后抗菌药物选择受到限制，治疗难度大；同时，也提示不能忽视抗菌药品被BCC污染的风险。
BCC 在低营养条件水性环境下仍能长时间存活，具有较强的环境适应性。BCC还被证实对药品中常用的抑菌剂，如尼泊金酯类（羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯）、季铵盐类（苯扎氯铵、苯扎溴铵）有一定耐受性。FDA发布的 2009—2013年因 BCC污染召回的产品中大部分含有抑菌剂，同时 FDA国家毒理学研究中心 2016—2017 年度报告中明确指出BCC对苯扎氯铵具有降解能力和耐药性，BCC可利用自身的外排系统和代谢系统降低苯扎氯铵的抑菌作用。沈海英等发现在含有尼泊金类抑菌剂的抗真菌乳膏中和含有对羟苯甲酯、羟苯乙酯的凝胶剂中均检出BCC。
2019 年美国药典（USP）发布了关于非无菌药品 中 BCC 检 查 的 通 则 <60> Microbiologicalexamination of nonsterile products—tests forBurkholderia cepacia complex，用于在规定的试验条件下检查产品中是否存在BCC，尤其适用于吸入剂或用于口服、口腔黏膜、皮肤和鼻腔的非无菌水溶液剂。USP通则<60>对BCC检查的菌株、培养基适用性检查（包括促生长能力、抑制能力及指示特性检查）、方法适用性试验、供试品检查方法以及培养基的制备等方面作了较详细的规定。需要注意该检测方法应采用 B. cepacia、B. cenocepacia 或 B.multivorans 菌株进行培养基促生长能力检查、采用铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌开展抑制能力检查 ，培 养 基 为 洋 葱 伯 克 霍 尔 德 菌 选 择 性 琼脂（BCSA），BCSA 培养基含有多黏菌素 B、万古霉素及庆大霉素，用以消除其他控制菌的生长干扰。方法适用性试验和供试品检查中出现的菌落形态特征观察和鉴定：BCC的指示特征为周围黄色的绿棕色菌落或者周围粉红色的白色菌落。
若 BCC 检验程序或供试品发生变化可能影响检验结果时，应重新开展方法适用性试验；对于有抑菌作用的供试品（ 包 括 含 抑 菌 剂 产 品 ），应 参 照 USP<61>Microbiological examination of nonsterile products：Microbial enumeration tests消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法适用性试验。《中国药典》（ChP）2020 年版未收载 BCC 检查的技术要求，考虑该菌群潜在的风险，药典委协同相关部门正在推进 BCC 检查和技术要求制定工作。现阶段，国内企业和检验机构可参考 USP<60>开展非无菌水性基质药品、原辅料、制药用水中的 BCC 检测；由于 BCC 具有较强环境适用性并有多种表型，需要关注方法的适用性及菌落的鉴定、分类。
3.1 BCC与水分活度
水分活度（water activity，aw）是产品中水分的能量状态的表征，可作为微生物风险控制的关键参数，比水分含量更有意义。2018年USP增加了关于 aw的通则<922>water activity，用于指导 aw值的测定和应用。aw指在相同温度下，产品中的水蒸气压与纯水蒸气压之比，数值介于 0～1。aw可用于快速有效评估微生物的繁殖能力，在高 aw值条件下，微生物生长良好；在低 aw值条件下，微生物生长则受 到 抑 制 ，微 生 物 低 于 最 低 生 长 aw 值 将 不 能繁殖。
USP<1112>Application of water activitydetermination to nonsterile pharmaceutical products，对 aw在非无菌药品中微生物控制的应用提供了指导，收载了微生物生长需要的 aw参考值。革兰阴性菌如铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和沙门氏菌在 aw＜0.91 的产品中不易增殖，而革兰阳性菌如金黄色葡萄球菌等在 aw＜0.86 时不易增殖 ，黑曲霉在 aw＜0.77 时不易增殖，aw＜0.60 时所有微生物均不会增值。文献报道BCC生长所需最低的aw为0.95，不同剂型和处方中BCC最低生长aw值略有差异，研究报道某凝胶剂中 BCC 最低生长 aw值为 0.97，与BCC 生长所需最低 aw值接近，表明该凝胶剂中的BCC 有进一步繁殖的可能。另有研究报道在以氯化钠为调节介质的液体制剂中 BCC 生长所需的最低aw值约为0.98，同时还发现aw值与BCC生长速率密切相关，BCC 在高 aw值的液体制剂中生长良好，而在低 aw 值的液体制剂中 BCC 的生长则受到抑制。因此，在非无菌水性基质药品早期处方开发和筛选阶段，可结合 aw值考察不同处方组成与aw的相关性，并通过调整可影响 aw值的介质（氯化钠、葡萄糖、乙醇、丙醇、甘油）浓度，优化制剂 aw值以降低BCC潜在的繁殖风险。
3.2 BCC与抑菌剂抑菌浓度
BCC 对非无菌水性基质药品中使用的一些抑菌剂具有耐药性，应关注相关抑菌剂对BCC的抑菌效力，必要时应增加BCC菌种作为抑菌效力评估试验测试菌株。抑菌剂用量低于最低抑菌浓度则BCC有进一步繁殖的可能，反之可降低BCC对抑菌剂耐受的潜在风险。有研究报道苯扎氯铵、苯扎溴铵、羟苯甲酯、羟苯乙酯对洋葱伯克霍尔德菌的最低抑菌浓度分别为 32、64、512、2 048 μg·mL−1，Kim 等发现苯扎氯铵对洋葱伯克霍尔德菌的最低抑菌浓度为50 µg·mL−1。
3.3 风险评估及控制
水性液体制剂、半固体制剂（悬浮液、洗剂、乳膏、软膏）比固体制剂具有更高的水分活度，水性基质的非无菌药品被 BCC 污染的风险较高。鉴于BCC具有抑菌剂耐药性，即使含有抑菌剂的非无菌药品 ，仍有可能在使用时存在不安全水平。ChP2020年版四部通则1107《非无菌药物微生物限度标准》中明确要求根据原辅料及其制剂的特性和用途、制剂生产工艺等因素，对其他可能存在的具有潜在危害的微生物进行检查。因此，产品生产过程、货架期甚至使用时（尤其是多剂量包装产品）都应基于风险识别、分析和评价，建立 BCC 控制措施和程序。《非无菌药品生产中的微生物质量考量》指出生产过程所使用的制药用水和天然组分是 BCC 最有可能的来源，并明确为确保产品质量和患者用药安全，非无菌水性药品生产中应执行完善的药品生产质量管理规范（cGMP）管理，包括建立基于 BCC风险管理的设计和控制、稳健的水系统管理、恰当的生产组分微生物负荷、经清洁和消毒的设备、经验证的BCC过程控制和成品检查规程等。
研究者可结合产品特有要素（剂型、水分活度、产品用途、包装、产品组成和比例等）和生产要素（生产过程、制水系统、生产环境、过程控制等）进行全面的 BCC风险评估，对 BCC进行研究和检查，制定合理的控制策略。从源头、过程控制上降低或避免BCC污染风险，建立有针对性的检查和控制方案，建立制药用水和制剂中BCC的控制策略。目前，ChP 尚未制定 BCC 的检查方法，研究者在菌种选择、检查方法及验证方面均可能存在困难。在ChP 公布法定方法之前，建议研究者对代表商业化生产批样品进行风险评估和检测分析，结合评估结果将 BCC 检查方法订入产品的放行标准。待国内法定方法公布后，建议结合研究情况将BCC作为控制菌的常规检查方法，订入药品注册标准，研究者可以根据产品批次数据的积累，参考ICH Q6A微生物限度决策树的要求，适时调整BCC的控制策略。
非无菌水性基质药品中不可接受微生物-BCC污染存在较高的风险，应引起国内制药行业的关注。研究者应根据产品特有要素、生产要素，开展非无菌水性基质药品中BCC污染的风险评估，制定全面有效的控制策略，建立经验证的控制菌检查方法，进行制药用水和制剂中 BCC 的分析和控制，确保非无菌水性基质药品微生物质量，保障公众用药安全。
来源：张帆，董武军，史敬芬，张耀．非无菌水性基质药品中洋葱伯克霍尔德菌群控制的一般考虑 [J]. 药物评价研究, 2022, 45(7): 1261-1265 .
英格尔医药致力于成为国内领先的医药研发和质量研究服务平台。实验室获得CMA、CNAS资质认可，并且在良好的ISO17025体系基础上，严格参照GMP规范运行。已建成四维一体的研发服务平台：医药研发平台、药物质量分析平台、医用材料研究平台。可以为国内外药企、科研机构等客户提供药物合成、制剂、质量分析；药包材相容性研究、医疗器械生物相容性；微生物、标准理化测试、临床生物样本分析；药物注册申报等全方位的药物研发技术服务。
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